Sehr geehrter Herausgeber,

Paraquat ist ein giftiges Herbizid, das schwere Lungenschäden verursachen kann, die zum Absterben von Alveolarepithelzellen, nachfolgender Lungenfibrose und Atemversagen führen können. Das Verständnis der Reparaturprozesse nach einer Paraquat-Verletzung ist entscheidend für die Entwicklung potenzieller Therapiestrategien zur Behandlung von Patienten mit Paraquat-Vergiftung. Allerdings ist das Reparaturprogramm bei Paraquat-geschädigten Lungen derzeit nicht bekannt. In dieser Studie analysierten wir Lungenparenchymproben einer 18-jährigen Patientin, die Paraquat eingenommen hatte und sich anschließend am 34. Tag nach der Vergiftung einer doppelten Lungentransplantation unterzogen hatte¹.

Histologische Analysen ergaben, dass die Alveolarstruktur durch die Paraquat-Toxizität stark gestört wurde. Immunfärbungsexperimente zeigten die Abwesenheit von PDPN⁺ alveoläre Epithelzellen vom Typ 1 (AT1) und ein dramatischer Rückgang von proSPC⁺ alveoläre Epithelzellen vom Typ 2 (AT2) in der durch Paraquat verletzten Lunge (Abb. 1a; Ergänzende Abb. S1a). Stattdessen wurden diese Bereiche mit α-SMA gefüllt⁺ Myofibroblasten (Abb. 1a). Der überlebende proSPC⁺ AT2-Zellen waren überwiegend an der Peripherie der durch Paraquat verletzten Lunge gebündelt, einige wenige waren im distalen Atemweg verstreut (ergänzende Abbildung). S1a, geb). Um Reparaturprogramme in der schwer verletzten Lunge zu untersuchen, führten wir Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalysen (scRNA-seq) durch. Nach einer integrierten Qualitätskontrollpipeline erhielten wir eine umfassende Sammlung von 19,171 Transkriptomen, die in vier große Zelltypgruppen eingeteilt wurden: EPCAM⁺ Epithelzellen (n = 4120), DCN⁺ Stromazellen (n = 2491), PTPRC⁺ Immunzellen (n = 10,431), und CDH5⁺ Endothelzellen (n = 2129) (Ergänzende Abbildung. S2a). Basierend auf kanonischen Abstammungsmarkern und unterschiedlichen molekularen Signaturen einzelner Zelltypen identifizierten wir insgesamt 45 Zelltypen/-zustände in der durch Paraquat verletzten Lunge (ergänzende Abbildung). S2b–e und Tabellen S1, S2).

a Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Analyse (oberes Feld) und Immunfärbung (unteres Feld) für proSPC (AT2-Zellmarker), PDPN (AT1-Zellmarker) und α-SMA (Myofibroblastenmarker) einer gesunden Lunge und einer durch Paraquat verletzten Lunge . Maßstabsbalken, 100 μm. b Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) Einbettung von Epithelzellen in die durch Paraquat verletzte Lunge und Annotation der Subpopulation. c Relative Anteile jedes abgeleiteten Epithelzelltyps b. d Immunfärbung für KRT5 (Basalzellmarker), SCGB1A1 (Keulen- und Becherzellmarker), MUC5AC (Becherzellmarker) und α-Ac-Tubulin (Flimmerzellmarker) der gesunden Lunge und der durch Paraquat verletzten Lunge. Die Wabenkapseln um die distalen Atemwege der durch Paraquat verletzten Lunge wurden auf den rechten Feldern vergrößert. Maßstabsbalken, 100 μm. e Wholemount-Färbung der durch Paraquat verletzten Lunge mit Antikörpern gegen KRT5 und α-SMA. Die vergrößerten Wholemount-Honeycomb-Pod-Strukturen sind in dargestellt e″. Der Z-Abschnitt in e‴ zeigt, dass KRT5⁺ Zellen in den Hülsen sind mit KRT5 verbunden⁺ Basalzellen in den Atemwegen. Skalierungsbalken ein e, 500 μm; Skalieren Sie die Balken ein e″ und e‴, 100 & mgr; m. f Immunfärbung der durch Paraquat verletzten Lunge mit Antikörpern gegen KRT5, SERPINB3 und CLCA2 (differenzierende Basalzellmarker). Der Einschub in der unteren linken Ecke zeigt ein vergrößertes Bild des weiß gepunkteten Kästchenbereichs. Maßstabsbalken, 100 μm. g CellRanks grobkörniger und gerichteter Übergang von Epithelzellen in der Paraquat-geschädigten Lunge. Die Heatmap stellt die mittlere Absorptionswahrscheinlichkeit jeder Zelle in den gegebenen Zelltypen bis hin zum Endschicksal dar. h Pseudozeit-Trajektorienanalyse, berechnet aus der UMAP-Einbettung von Epithelzellen in b durch RNA-Geschwindigkeit. Pfeile zeigen vorhergesagte Abstammungsverläufe an. i NOTCH-Signalisierungspunktzahl in EPCAM⁺ Epithelzellen der Paraquat-geschädigten Lunge, die auf UMAP projiziert werden und sich darin einbetten b. j Immunfärbung der Paraquat-geschädigten Lunge mit Antikörpern gegen KRT5, HIF1A und HES1. Der Einschub in der unteren linken Ecke zeigt ein vergrößertes Bild des weiß gepunkteten Kästchenbereichs. Maßstabsbalken, 100 μm. k Hypoxie-HIF1A-Signalwert in allen Zellen der durch Paraquat verletzten Lunge, projiziert auf die UMAP-Einbettung in der ergänzenden Abbildung. S2b. l Immunfärbung der Paraquat-geschädigten Lunge mit Antikörpern gegen proSPC, HIF1A und HES1. Die weiße gepunktete Linie zeigt die Peripherie der Lunge an. Maßstabsbalken, 100 μm.

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Unvoreingenommene Clusteranalyse von EPCAM⁺ Epithelzellen zeigten zehn verschiedene Subpopulationen (Abb. 1b). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Immunfärbung gab es keine PDPN⁺ AT1-Zellpopulation, was auf einen vollständigen Verlust der Gasaustauscheinheiten in der durch Paraquat geschädigten Lunge hinweist. Diese zehn Teilpopulationen umfassten SFTPC⁺ AT2-Zellen und neun Subpopulationen von Atemwegsepithelzellen, wobei letztere sieben klassisch definierte Zelltypen umfassen (basal, MUC5AC^Highs Kelch, SAA^Highs Kelch, SCGB1A1^niedrig Becher-, Keulen-, Flimmer- und pulmonale neuroendokrine Zellen) und zwei Zwischenstadien (differenzierende Basalzellen und differenzierende Keulenzellen) (Abb. 1b; Ergänzende Abb. S3a). Differenzierende Basalzellen exprimierten beide Basalzellmarker (KRT5 und KRT15) und Becherzellmarker (SERPINB3, SERPINB4 und CLCA2)² (Ergänzende Abb. S3a), was darauf hinweist, dass es sich um Vorläufer von Becherzellen handelt. Neu identifizierte differenzierende Keulenzellen exprimierten Marker beider Keulenzellen (SCGB3A2 und SCGB1A1) und Becherzellen (MUC5B) (Ergänzende Abb. S3a). Da Becherzellen als terminal differenzierter Zelltyp gelten, können die differenzierenden Keulenzellen ein Zwischenstadium der Differenzierung von Keulenzellen zu Becherzellen darstellen.

In gesunden Spenderlungen EPCAM⁺ Epithelzellen bestehen sowohl aus Alveolarepithelzellen (AT1- und AT2-Zellen) als auch aus Atemwegsepithelzellen, wobei Alveolarepithelzellen über 40 % davon ausmachen EPCAM⁺ Bevölkerung^3,4. Allerdings sank in der durch Paraquat geschädigten Lunge der Anteil der Alveolarepithelzellen (die AT2-Zellpopulation) deutlich auf 9.4 %, während der Anteil der Atemwegsepithelzellen auf 90.6 % anstieg (Abb. 1c). Insbesondere waren die Anteile an Atemwegsstamm-/Vorläuferzellen, einschließlich Basalzellen (27.4 %), Keulenzellen (17.5 %), differenzierenden Basalzellen (7.4 %) und differenzierenden Keulenzellen (4.7 %), signifikant erhöht (Abb. 1c). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die durch Paraquat verletzte Lunge einem aktiven Atemwegsreparaturprogramm, aber einem unzureichenden Alveolarreparaturprogramm unterzogen wird.

Um die Verteilung der erhöhten Atemwegsepithelzellen in der durch Paraquat verletzten Lunge zu untersuchen, führten wir Immunfärbungsanalysen durch. Ähnlich wie in der gesunden Lunge bestanden die pseudostratifizierten Epithelzellen der distalen Atemwege in der durch Paraquat verletzten Lunge aus KRT5⁺ Basalzellen, SCGB1A1⁺MUB5AC^- Clubzellen und α-Ac-Tubulin⁺ Flimmerzellen (Abb. 1d). Wir beobachteten jedoch Schleimansammlungen und abgeschuppte Epithelzellen, die das Atemwegslumen in der durch Paraquat verletzten Lunge verstopften. Darüber hinaus beobachteten wir viele „Wabenschalen“-Strukturen in den Alveolarregionen rund um die distalen Atemwege, die in der gesunden Lunge nicht beobachtet wurden (Abb. 1d). Die vorherrschenden Epithelzellen in Wabenkapseln waren positiv für KRT5 (Abb. 1d). Durch Ganzkörperfärbung haben wir außerdem herausgefunden, dass diese KRT5⁺ Wabenepithelzellen hielten immer noch eine enge Verbindung mit dem KRT5 aufrecht⁺ Epithelzellen der distalen Atemwege (Abb. 1e; Ergänzende Videos S1, S2). Die meisten KRT5⁺ Epithelzellen in Wabenkapseln exprimierten stark die Marker differenzierender Basalzellen, SERPINB3 und CLCA2 (Abb. 1f). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Basalzellen der Atemwege in den distalen Atemwegen differenzierende Basalzellen hervorrufen und abnormale Wabenkapseln in der durch Paraquat verletzten Lunge bilden.

Frühere Studien haben gezeigt, dass Stamm-/Vorläuferzellen der Atemwege nicht nur verlorene Epithelzellen der Atemwege wieder auffüllen, sondern auch am Programm zur Reparatur ektopischer Alveolar nach Lungenverletzungen teilnehmen^5,6,7,8. Um die Abstammungsbeziehungen von Atemwegsstamm-/Vorläuferzellen im Zusammenhang mit Paraquat-induzierten schweren Lungenschäden weiter aufzuklären, verwendeten wir RNA-Geschwindigkeits- und CellRank-Analysen. Unsere Analysen ergaben, dass Basalzellen eine höhere Neigung zur Bildung differenzierender Basalzellen besitzen (Abb. 1g, h). Keulenzellen können sich durch die differenzierenden Keulenzellen in Becherzellen differenzieren, was die Annahme stützt, dass differenzierende Keulenzellen eine Zwischenstufe darstellen, die Keulenzellen mit Becherzellen verbindet (Abb. 1g, h). Frühere Studien unter Verwendung von Mausmodellen für Lungenverletzungen haben gezeigt, dass Vorläuferzellen der Atemwege in AT2- und AT1-Zellen differenzieren können^5,6,7. Unsere Analysen zeigten jedoch eine begrenzte Wahrscheinlichkeit, dass sich Basalzellen, differenzierende Basalzellen und Keulenzellen in der durch Paraquat verletzten Lunge zu AT2-Zellen differenzieren (Abb. 1g, h). Im Gegensatz dazu zeigen AT2-Zellen in der Paraquat-geschädigten Lunge eine höhere Neigung zur Differenzierung in Keulenzellen. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass sowohl AT2-Zellen als auch Atemwegsstamm-/Vorläuferzellen in der durch Paraquat verletzten Lunge eine deutlich verringerte Fähigkeit zur Regeneration des Alveolarepithels aufweisen, was letztendlich zu einem irreversiblen Verlust von Gasaustauscheinheiten führt.

Um den regulatorischen Weg zu untersuchen, der einer fehlerhaften Reparatur von Atemwegsstamm-/Vorläuferzellen am Alveolarepithel zugrunde liegt, verglichen wir die Genexpression in differenzierenden Basalzellen in gesunden Spenderlungen⁹ und die durch Paraquat verletzte Lunge. Wir fanden heraus, dass Gene, die an der Regulierung des NOTCH-Signals und der Reaktionen reaktiver Sauerstoffspezies beteiligt sind, in der durch Paraquat geschädigten Lunge stark hochreguliert sind (Abb. 1i; Ergänzende Abb. S3b). Ausdruck von HES1 und HEY1, Zielgene des NOTCH-Signals, war signifikant erhöht, was die Aktivierung des NOTCH-Signals in differenzierenden Basalzellen unterstützt (Abb. 1i, j; Ergänzende Abb. S3c). Angesichts der Tatsache, dass reaktive Sauerstoffspezies an der hypoxischen Reaktion beteiligt sind¹⁰Wir haben die Expression des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1 Alpha (HIF1A), einem bekannten Kennzeichen von Hypoxie, weiter analysiert¹¹. Die Immunfärbungsanalyse zeigte, dass die Mehrheit der Wabenbasalzellen positiv für HIF1A war (Abb. 1j), was auf die Aktivierung der Hypoxie-induzierten Signalübertragung in diesen differenzierenden Basalzellen hinweist. Bemerkenswerterweise wird HES1 auch in den meisten HIF1A stark exprimiert⁺ Wabenbasalzellen (Abb. 1j). Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit einer früheren Studie, in der berichtet wurde, dass Hypoxie die NOTCH-Signalübertragung aktivieren und die Differenzierung von Atemwegs-Vorläuferzellen in Alveolarepithelzellen in durch das H1N1-Influenzavirus geschädigten Lungen blockieren kann¹². Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die durch Hypoxie induzierte Aktivierung des NOTCH-Signals in differenzierenden Basalzellen zu einer verminderten Fähigkeit zur Bildung von Alveolarepithelzellen in der durch Paraquat geschädigten Lunge führt.

Signifikanter Anstieg von HIF1A⁺ Zellen und ihre weite Verbreitung in der durch Paraquat geschädigten Lunge deuteten darauf hin, dass die Mikroumgebung der Lunge möglicherweise weitgehend hypoxisch sein könnte. Tatsächlich wiesen neben differenzierenden Basalzellen auch andere Zelltypen, darunter Basalzellen, AT2-Zellen, Monozyten, Makrophagen, Neutrophile und Myofibroblasten, im Allgemeinen hohe Hypoxiewerte auf (Abb. 1k). HIF1A⁺ AT2-Zellen wurden auch an der Peripherie der durch Paraquat geschädigten Lunge beobachtet, und einige AT2-Zellen exprimierten HES1 (Abb. 1l), was darauf hindeutet, dass die durch Hypoxie induzierte NOTCH-Signalisierung auch in AT2-Zellen aktiviert wurde. Es wurde gezeigt, dass eine anhaltende Aktivierung des NOTCH-Signals die Differenzierung von AT2- zu AT1-Zellen in der Lunge von Mäusen hemmt¹³. Wir spekulieren, dass die Hypoxie-induzierte Aktivierung des NOTCH-Signals in AT2-Zellen die Differenzierung von AT2- zu AT1-Zellen während der Alveolarreparatur in dieser durch Paraquat verletzten Lunge beeinträchtigen könnte.

In dieser Studie haben wir experimentell gezeigt, dass die Epithelregenerationsprogramme in der durch Paraquat geschädigten Lunge gestört sind. Ein massiver Zelltod nach einer Paraquat-Vergiftung führt zu einer erheblichen Infiltration von Immunzellen, einem Verlust von Gasaustauscheinheiten und einer Lungenfibrose (ergänzende Abbildung). S2b), was zu einer ausgedehnten hypoxischen Mikroumgebung im Lungengewebe führt. Diese Mikroumgebung kann zu den fehlerhaften Reparaturprogrammen beitragen, indem sie das NOTCH-Signal aktiviert und die Differenzierung von Atemwegs- und Alveolarstamm-/Vorläuferzellen stört, was die Schädigung des Lungengewebes verschlimmert. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass eine Lungentransplantation möglicherweise die einzig praktikable Behandlung für Patienten mit schwerer Paraquat-Vergiftung ist. Wichtig ist, dass unsere Studie die entscheidende Rolle einer geeigneten Mikroumgebung bei der Regeneration funktioneller Alveolareinheiten hervorhebt, die von der Differenzierung neu gebildeter AT1-Zellen abhängt. Da Hypoxie ein häufiges Merkmal schwerer Lungenerkrankungen ist, könnten zukünftige Therapiestrategien, die auf die hypoxische Lungenmikroumgebung abzielen, wie die Reduzierung der Hypoxie oder die Hemmung der NOTCH-Signalübertragung, vielversprechend für die Behandlung schwerer Lungenverletzungen sein.