Zellkultur

E14-mESCs wurden von der Stammzellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften gekauft. Sie wurden bei 37 °C in 5 % CO kultiviert₂ in einem Inkubator. Das Kulturmedium war Knockout DMEM (Gibco, 10829-018), versetzt mit 15 % fötalem Rinderserum (FBS, Gibco, 10099-141), 1× MEM nicht-essentielle Aminosäuren (Gibco, 11140-050), 1× GlutaMAX (Gibco). [25]. mESCs wurden zur Passage auf mit Mitomycin C behandelten embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus oder für Tests in mit 0.1 % Gelatine beschichteten Schalen gehalten. Das Medium wurde jeden Tag gewechselt und die Zellen wurden alle 3 Tage passagiert.

Haspin-Knockout in mESCs

Um Haspin auszuschalten, haben wir zwei Leit-RNAs (gRNAs) entworfen, die auf Haspin-kodierende Sequenzen abzielen. Die gRNAs wurden angelagert und dann in den BbsI-verdauten Vektor pX459 kloniert. Diese beiden Haspin-gRNA-Plasmide wurden unter Verwendung von Lipofectamine 14 (Lip2000, Invitrogen, 2000) in WT E11668019-Zellen co-transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium für 1.5 Tage auf ES-Medium, ergänzt mit 3 μg/ml Puromycin, umgestellt und die überlebenden Einzelklone wurden gepickt und auf Platten mit 96 Vertiefungen übertragen. Um Haspin-KO-Zellen zu erhalten, verwendeten wir eine Immunfärbung von H3T3ph, um H3T3ph-negative Einzelklone auszuwählen. Anschließend wurden die genomischen DNA-Fragmente der Haspin-KO-Zellen durch PCR amplifiziert und sequenziert, um zu bestätigen, dass das Haspin-Gen zerstört war.

Induktion einer asymmetrischen Stammzellteilung

Bei der Untersuchung der Fähigkeit zur asymmetrischen Stammzellteilung wurden E14-mESCs auf N2B27-Medium umgestellt und nach der Passage 16 Stunden lang auf mit Gelatine beschichteten Zellkulturschalen mit Glasboden (Nest, 801001) inkubiert. N2B27-Medium enthält DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), Neurobasal (Gibco, 21103-049) (1:1), 50 μM 2-Mercaptoethanol, 0.5 % N2 (Gibco, 17502-048), 1 % B27 (Gibco). , 17504-044), 0.033 % BSA 7.5 % Lösung (Thermo Fisher, 15260037) und 1× GlutaMAX (Gibco, 35050-061) [24]. Nach 16 Stunden wurden sofort Immunfluoreszenz-Färbungsexperimente an den Zellen durchgeführt und anschließend wurden die Zellen für die konfokale Bildgebung vorbereitet. Nanog, einer der wichtigsten Pluripotenzmarker, wurde schon immer zur Bestimmung des ACD-Verhältnisses verwendet [24,25,26]. Wenn das Signalverhältnis von Nanog zwischen den beiden Tochterzellen größer als 1.2 ist, wird es als ACD betrachtet [53].

Plasmidkonstruktion und Überexpression

Die Vektoren Chek2-eGFP und Chek2-RFP wurden von Dr. Zhiyong Mao erhalten. Wir haben die kodierenden Sequenzen von Haspin und Wnt5a aus cDNA von mESCs amplifiziert und sie dann in den Chek2-eGFP-Vektor subkloniert, um die Chek2-kodierende Sequenz zu ersetzen. Zur Überexpression wurde der Haspin-eGFP- oder Wnt5a-RFP-Vektor unter Verwendung von Lip14 in E2000-mESCs transfiziert. Nach 3 Tagen Transfektion wurden GFP-positive Zellen mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung grüner Fluoreszenz gereinigt. Die Effizienz der Überexpression wurde mittels qRT‒PCR und Western Blot gemessen.

siRNAs

E14-Zellen wurden mit siRNA-Targeting transfiziert Haspin or Wnt5a 48 Stunden lang mit Lip2000 gemäß den Anweisungen des Herstellers. Der Haspin machen Wnt5a siRNAs wurden von Ribobio (Guangzhou, China) synthetisiert und ihre Ziel-DNA-Sequenzen sind in der Ergänzungstabelle aufgeführt 1.

Haspinkinase-Inhibitor CHR-6494

Der Haspin-Kinase-Inhibitor CHR-6494 (MCE, HY-15217) wurde in DMSO gelöst, um eine 10 mM Stammlösung zu erzeugen, und dann bei −20 °C gelagert [27]. Nach der Zellpassage und -adhärenz wurde das Medium auf 0.5 μM oder 1 μM CHR-6494 hinzugefügtes ES-Medium oder N2B27-Medium geändert und 1 μM DMSO wurde als Kontrolle verwendet. Das Medium wurde jeden Tag gewechselt.

Zellsynchronisation

Um den H3T3ph-Spiegel zu messen, haben wir die mESCs synchronisiert. Die Zellen wurden durch 1-stündige Behandlung mit 3915 μg/ml Colchicin (Sigma, C8) auf die Metaphase synchronisiert und anschließend wurden die Zellen für Western Blot oder Immunfluoreszenzfärbung gesammelt.

Färbung mit alkalischer Phosphatase

Die mESC-Färbung mit alkalischer Phosphatase (AP) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung des Alkaline Phosphatase Detection Kit (Millipore, SCR004) durchgeführt. Zuerst wurden die Zellen 1 Minute lang bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd in PBS fixiert und dann 5 Minuten lang mit 1 × PBST gewaschen. Als nächstes wurden Fast Red Violet-Lösung und Napthol AS-BI-Phosphatlösung 10 Minuten lang im Dunkeln auf die mESCs aufgetragen. Die gefärbten Zellen wurden mit 1× PBS gewaschen und unter einem Umkehrmikroskop untersucht.

Wachstumskurven

Ungefähr 20,000 Zellen wurden in jede Vertiefung von Platten mit 24 Vertiefungen (Thermo, 142475) ausgesät. Anschließend wurden Wachstumskurven nach 24, 48, 72, 96 und 120 Stunden erstellt und drei Vertiefungen jeder Linie gezählt, um die Zellzahl zu bestimmen. Die Zellzahl wurde mit Countess II (Thermo) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen. Die restlichen Zellen wurden mit 1x PBS gewaschen und das Medium täglich durch frisches Medium ersetzt.

Analyse des Zellzyklus

E14-mESCs wurden in einer Zellkulturplatte mit sechs Vertiefungen (Thermo, 140675) ausplattiert. Drei Tage später wurden die Zellen trypsinisiert und über Nacht bei 70 °C in kaltem 4 %igem Ethanol fixiert. Die Zellen wurden resuspendiert und mit RNaseA-Lösung 37 Minuten bei 30 °C inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit 50 μg/ml Propylidiniodid (PI)-Lösung für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wurde BD FACS Aria II verwendet, um die Häufigkeit von Zellen in der G1-Phase, S-Phase und G2/M-Phase zu bewerten.

Embryoidkörpererzeugung

Zur Erzeugung von Embryoidkörpern (EBs) wurde die Methode des hängenden Tropfens verwendet. E14-Zellen wurden dissoziiert und in EB-Medium in einer Konzentration von 1–1.5 × 10 resuspendiert⁵ Zellen/ml. EB-Medien enthalten Knockout DMEM, 15 % FBS, 1× MEM nichtessentielle Aminosäuren, 1× Natriumpyruvat und 0.1 mM 2-Mercaptoethanol [54]. Anschließend wurden 20 μl hängende Tropfen drei Tage lang im Deckel einer 10-cm-Schale kultiviert. Um ein Austrocknen des hängenden Tropfens zu verhindern, wurde 1× PBS auf die Unterseite des Deckels gegeben. Nach drei Tagen wurden die EBs gesammelt, in Platten mit extrem geringer Haftung (Corning, 3474) überführt und weitere drei Tage in EB-Medien kultiviert. EB-Proben wurden gesammelt und dann einer qRT-PCR unterzogen, um die Genexpressionsniveaus zu analysieren.

Teratombildung

Die Mäuse wurden gemäß den Richtlinien des Animal Research Institute Committee der Tongji-Universität, Shanghai, China, gehalten und behandelt. Zur Teratombildung wurden E14-Zellen trypsiniert, um einzelne Zellen zu erzeugen. Für jeden Zelltyp insgesamt 1 × 10⁶ Die Zellen wurden in 100 μl EB-Medium resuspendiert und subkutan in die beiden Flanken von immundefizienten 8 Wochen alten männlichen NOD-SCID-Mäusen injiziert (n = 4 Tumoren/Gruppe). Vier Wochen nach der Inokulation wurden die Teratome geerntet und gewogen. Anschließend wurden diese Teratome in 4 % PFA gesammelt, in Paraffin eingebettet und in einem Mikrotom geschnitten. Schnitte jedes Teratoms wurden mit Hämatoxylin/Eosin (H&E) gefärbt und weiter analysiert.

Quantitative Echtzeit-PCR (qRT‒PCR)

Die Gesamt-RNA wurde aus WT- und Haspin-KO-mESCs, EBs und Teratomen mit TRIzol (Invitrogen, 10296010) gemäß dem Protokoll extrahiert. Die Gesamt-RNA wurde mit einem NanoDrop 2000-Spektrophotometer (Thermo) quantifiziert. Anschließend wurde die umgekehrte Transkription in cDNA mit dem PrimeScript RT Reagent Kit mit gDNA Eraser (Takara, RR047) durchgeführt. qRT‒PCR wurde mit TB Green Fast qPCR Mix (Takara, RR430) mit einem Reaktionsvolumen von 20 μl und dem Bio-Rad CFX Connect-System (Bio-Rad) durchgeführt. Die relativen mRNA-Expressionsniveaus wurden auf normalisiert GAPDH und mit der 2-Delta-Delta-Ct-Methode analysiert, um die relative Faltungsänderung zu berechnen. Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle aufgeführt 1.

Immunfluoreszenzfärbung

Zur Immunfluoreszenzfärbung wurden auf Zellkulturschalen mit Glasboden gezüchtete Zellen mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur 30 Minuten lang fixiert. Die Proben wurden mit PBST (0.2 % Triton X-100) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur permeabilisiert. Anschließend wurden die Zellen 5 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 1 % BSA blockiert. Anschließend wurden die Proben über Nacht mit Primärantikörpern bei 4 °C inkubiert. Darüber hinaus wurden die Proben dreimal mit PBST gewaschen und 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Sekundärantikörpern und Hoechst 33342 (Invitrogen, H3570) inkubiert. Anschließend wurden die Proben dreimal bei Raumtemperatur in PBST gewaschen und im Dunkeln gelagert. Die Bilder wurden mit einem inversen Zeiss-LSM880-Mikroskop aufgenommen. Die Daten wurden mit Zeiss-Software und ImageJ-Software verarbeitet.

Western-Blotting

Zur Proteinextraktion wurden mESCs unter Verwendung von RIPA-Puffer (Beyotime, P0013B), ergänzt mit Proteaseinhibitoren (Beyotime, P1005) und Phosphataseinhibitoren (Beyotime, P1081), lysiert, und dann wurden die Lysate 12,000 Minuten lang bei 4 rcf und 20 °C zentrifugiert . Die Proteinkonzentration des Überstands wurde mit dem BCA Protein Assay (Thermo, 23227) bestimmt und anschließend normalisiert. Gleiche Mengen an Proteinproben wurden mit 15 % SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt und dann auf 0.2 μm PVDF-Membranen (Millipore, ISEQ00010) übertragen. Die Membranen wurden mit TBST, ergänzt mit 5 % BSA, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert und dann über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern inkubiert. Als nächstes wurden die Membranen dreimal mit TBST gewaschen, gefolgt von HRP-konjugierten Sekundärantikörpern für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Membranen wurden mit dem Chemilumineszenzreagenz ECL (Thermo, 34577) sichtbar gemacht.

RNA-Sequenz- und Datenanalyse

RNA wurde aus Haspin-KO und Kontroll-mESCs unter Verwendung von TRIzol extrahiert. Anschließend wurde 1 μg RNA hergestellt, um eine Sequenzierungsbibliothek zu erstellen. Die Bibliotheken wurden auf dem IIIumina NovaSeq 6000 (Berry genomics) gemäß dem Protokoll sequenziert. Zur Datenanalyse wurden die getrimmten Lesevorgänge (mit Cutadapt, v1.9.1) mit Hisat10 (v2) auf das Mausgenom (mm2.0.1) abgebildet. Die Analyse des differenziell exprimierten Gens (DEG) wurde mit DESeq2 durchgeführt. Die wesentlichen DEGs wurden mit identifiziert P Werte < 0.05 und fache Änderung > 2, und dann wurde GOSeq (v1.34.1) verwendet, um Begriffe der Genontologie (GO) zu identifizieren.

Dual-Luciferase-Reporter-Assay

Wir amplifizierten Fragmente des Wnt5a-Promotors (~2 kb stromaufwärts des TSS) und Pax2-CDS und klonierten dann Wnt5a in den pGL3-Luciferase-Reportervektor und Pax2-CDS in den CAG-eGFP-Überexpressionsvektor. mESCs wurden in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 2 × 10 ausgesät⁵ Zellen/ml. Am nächsten Tag wurden Pax2-eGFP-, pRL-SV40-, pGL3-Basic- oder pGL3-Wnt5a-Promotor mit Lip2000 in Zellen cotransfiziert und 36 Stunden lang kultiviert. Andererseits wurden pRL-SV40- und pGL3-Wnt5a-Promotor in WT-Zellen co-transfiziert. Nach 8 Stunden wurde den transfizierten Zellen ein Medium verabreicht, das WT, DMSO, 0.5 μM CHR-6494 und 1 μM CHR-6494 enthielt, und sie wurden 36 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurden die Zellen geerntet und lysiert, um die Luciferase-Aktivität gemäß dem Protokoll des Herstellers (Promega, E1910) zu messen.

Chromatin-Immunpräzipitation

Chromatin-Immunpräzipitationstests (ChIP) wurden mit dem Magna ChIP A/G-Kit (Millipore) gemäß dem Protokoll durchgeführt. Kurz gesagt, mESCs wurden vernetzt und dann in 200–500 bp große Fragmente beschallt, die anschließend mit Antikörpern gegen Pax2 (Cell Signaling Technology, 9666) oder IgG immunpräzipitiert wurden. Anschließend wurde die präzipitierte Chromatin-DNA gewonnen und mittels qRT-PCR-Assays analysiert.

Antikörper

Die folgenden Primärantikörper wurden für Western Blot oder Immunfluoreszenzfärbung verwendet: Anti-H3T3ph (Abcam, ab130940), Anti-H3S10ph (Abcam, ab14955), Anti-GAPDH (Proteintech, HRP-60004), Anti-Caspase-3 (Cell Signaling). Technologie, 9662S), Anti-gespaltenes Caspase-3 (Cell Signaling Technology, 9664S), Anti-α-Tubulin (Aktives Motiv, 39527), Anti-Nanog (Abcam, ab80892), Anti-Sox2 (Abcam, ab79351), Anti -Oct4 (Abcam, ab27985), Anti-Klf4 (Abcam, ab129473), Anti-Wnt5a (Abcam, ab235966) und Anti-Pax2 (Cell Signaling Technology, 9666).

statistische Analyse

Alle statistischen Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Jeder Test wurde mindestens dreimal wiederholt und die Ergebnisse wurden mit SPSS 20.0 analysiert. Die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen wurde mithilfe ungepaarter zweiseitiger Student-t-Tests bestimmt. *P < 0.05, **P < 0.01 und ***P < 0.001 galten als statistisch signifikante Unterschiede und P > 0.05 wurde als nicht signifikant angesehen.

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• Quelle: https://www.nature.com/articles/s41420-023-01604-w