02 (Nanowerk-Scheinwerfer) Mikrofluidik, die Technologie zur präzisen Steuerung von Flüssigkeiten im Submillimeterbereich, verspricht seit langem, die biologische Forschung und medizinische Diagnostik zu revolutionieren. Durch die Miniaturisierung von Tests in winzige Wasser-in-Öl-Tröpfchen können diese Plattformen einzelne Zellen mit beispielloser Geschwindigkeit und Effizienz analysieren und gleichzeitig die Reagenzienkosten drastisch senken. Jedes Tröpfchen im Picoliter-Maßstab dient als isolierter Mikroreaktor, der Hochdurchsatzstudien des Zellverhaltens ermöglicht und vielfältige Anwendungen vom Arzneimittelscreening bis zur Analyse seltener Zellen ermöglicht. Die Erschließung des vollen Potenzials der Tröpfchen-Mikrofluidik wurde jedoch durch die Herausforderung behindert, den Inhalt dieser winzigen Kompartimente schnell und umfassend zu analysieren. Herkömmliche Ansätze basieren auf komplexen und teuren Mikroskopieaufbauten, bei denen Hochgeschwindigkeitskameras verwendet werden, um jedes Tröpfchen abzubilden, während es durch das Gerät fließt. Die technische Komplexität und die hohen Kosten, die mit solchen Systemen verbunden sind, haben die weit verbreitete Einführung tröpfchenbasierter Techniken in der Forschung und im klinischen Umfeld eingeschränkt. Jetzt hat ein multidisziplinäres Team von Wissenschaftlern OptiDrop entwickelt, ein innovatives Gerät, das diese Einschränkungen auf geniale Weise überwindet, indem es optische Fasern direkt in einen Mikrofluidik-Chip integriert. Dieser neuartige Ansatz ermöglicht die Erkennung mehrerer optischer Parameter aus einzelnen Tröpfchen und deren Inhalten, ohne auf ein Mikroskop oder eine Kamera angewiesen zu sein. Das Ergebnis, berichtet in Microsystems & Nanoengineering („Multiplex-Fluoreszenz- und Streudetektion mit Einzelzellauflösung unter Verwendung von On-Chip-Faseroptik für mikrofluidische Tröpfchenanwendungen“) ist eine miniaturisierte, erschwingliche und benutzerfreundliche Plattform, die die Leistungsfähigkeit der Multiparameter-Einzelzellenanalyse in ein Tischformat bringt.
a Die OptiDrop-Plattform besteht aus einem mikrofluidischen Chip mit einem Öl- und Wassereinlass zur Bildung von Tröpfchen an der Flussfokussierungsstelle. Die wässrige Phase ist in Tröpfchen eingekapselt und fließt anschließend durch die optische Abfragestelle (Einschub), die von einer Reihe optischer Faserrillen flankiert wird, die um den zentralen Kanal herum angeordnet sind. Die Rillen auf dem Chip werden verwendet, um die optischen Fasern in festgelegten Winkelpositionen unterzubringen, was eine effektive Tröpfchenbeleuchtung mit dem einfallenden Laserlicht und die Sammlung von Streulicht- und Fluoreszenzsignalen ermöglicht, wenn das Tröpfchen den Lichtstrahl passiert. Der Glasfaserausgang wird zur Erkennung in ein PMT eingekoppelt. Die TTL-Impulszählungen von jedem PMT werden von einem FPGA-Chip mit einem Impulszähler integriert und als rohe Signalintensitätsspitzendaten aufgezeichnet. Die Rohdaten können weiter analysiert werden, um Fluoreszenzintensitäten der interessierenden Zellen zu identifizieren oder zu messen. b Auf dem Tisch montiertes Gerät mit einem Fußlineal zur Waage sowie einem Live-Datenstrom-Anzeigebildschirm und Spritzenpumpen. (Bild: Microsystems & Nanoengineering, CC BY 4.0) Die Kerninnovation von OptiDrop liegt in der strategischen Positionierung optischer Fasern rund um den mikrofluidischen Kanal. Während jedes Tröpfchen den Abfragepunkt passiert, wird es von einem Laser beleuchtet und erzeugt Streu- und Fluoreszenzsignale. Diese optischen Signale werden effizient von im 45°-Winkel angeordneten Fasern gesammelt und dann an separate Detektoren weitergeleitet. Maßgeschneiderte Elektronik digitalisiert die Signale in Echtzeit und ermöglicht so eine sofortige Visualisierung und Analyse des optischen Profils jedes Tröpfchens.
Um die Leistung von OptiDrop zu validieren, charakterisierten die Forscher zunächst seine Empfindlichkeit und seinen Dynamikbereich mithilfe standardisierter Fluoreszenzfarbstoffe. Beeindruckend ist, dass das Gerät Farbstoffkonzentrationen von nur 1 Nanomolar erkennen konnte und damit mit den Nachweisgrenzen herkömmlicher Instrumente mithalten konnte, während es nur einen Bruchteil des Probenvolumens benötigte. Darüber hinaus skalierte die von OptiDrop gemessene Fluoreszenzintensität linear über einen weiten Konzentrationsbereich und gewährleistete so eine genaue und zuverlässige Quantifizierung.
Anschließend demonstrierten die Forscher die Fähigkeiten von OptiDrop zur Partikelanalyse mithilfe von Mikrokügelchen unterschiedlicher Größe und Fluoreszenzintensität als Zellmimetika. Die Plattform konnte die Perlen anhand ihrer physikalischen Abmessungen und optischen Eigenschaften leicht unterscheiden. Bemerkenswert ist, dass OptiDrop selbst in einer heterogenen Mischung aus schwach und hell fluoreszierenden Perlen jede Subpopulation genau identifizierte und aufzählte. Dies unterstreicht die Robustheit des Systems bei der Analyse komplexer biologischer Proben mit unterschiedlichen Zelltypen.
Um den Nutzen der Plattform für eine biologisch relevante Anwendung zu demonstrieren, führte das Team einen Live-Cell-Assay durch, bei dem die Oberflächenexpression von Proteinen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) auf Immunzellen untersucht wurde. MHC-Moleküle sind entscheidende Regulatoren der Immunantwort gegen Krankheitserreger und abnormale Zellen und machen ihre Expressionsniveaus zu wertvollen Biomarkern. Durch die Nutzung fluoreszierend markierter Antikörper ermöglichte OptiDrop den gleichzeitigen Nachweis von MHC-Klasse-I- und -II-Proteinen auf einzelnen, in Tröpfchen eingekapselten Zellen. Die Stimulation der Zellen mit Interferon-Gamma, einem immunstimulierenden Zytokin, löste die erwartete Hochregulierung der MHC-Expression aus, die von der OptiDrop-Plattform empfindlich quantifiziert wurde.
Die Entwicklung von OptiDrop markiert einen bedeutenden Schritt in Richtung Demokratisierung modernster Einzelzellanalysefunktionen. Durch die Überwindung der Kosten- und Komplexitätsbarrieren, die die Einführung der Tröpfchen-Mikrofluidik behindert haben, macht diese innovative Plattform leistungsstarke zelluläre Abfragewerkzeuge für ein breiteres Spektrum von Forschern und Klinikern zugänglich. Aufgrund seiner Erschwinglichkeit, Benutzerfreundlichkeit und Robustheit eignet es sich gut für den routinemäßigen Einsatz in biomedizinischen Forschungslabors und Point-of-Care-Diagnoseumgebungen.
Die Einsatzmöglichkeiten von OptiDrop sind umfangreich und weitreichend. Im Bereich der Krankheitsüberwachung könnte es die hochempfindliche Erkennung seltener Biomarker ermöglichen und so eine nicht-invasive Frühdiagnose und Beurteilung des Behandlungserfolgs erleichtern. Die Integration in Arbeitsabläufe zur Einzelzellsequenzierung kann eine direkte Korrelation visueller Phänotypen mit Genexpressionsprofilen ermöglichen und so ein umfassenderes Verständnis der Zellzustände ermöglichen. Darüber hinaus machen das geschlossene Design der Plattform und die Fähigkeit, klinische Proben schnell zu verarbeiten, sie besonders attraktiv für Tests auf Infektionskrankheiten und andere zeitkritische diagnostische Anwendungen.
Obwohl OptiDrop einen erheblichen Fortschritt darstellt, gibt es noch Raum für weitere Optimierung und Erweiterung seiner Fähigkeiten. Eine Erhöhung des Durchsatzes durch die Ermöglichung schnellerer Tröpfchenflussraten und die Erzeugung kleinerer Tröpfchen könnte die Effizienz und Skalierbarkeit verbessern. Durch die Integration aktiver Sortierfunktionen könnten Benutzer bestimmte interessierende Subpopulationen anhand ihrer optischen Signaturen isolieren und so nachgelagerte molekulare Analysen ermöglichen. Darüber hinaus wird die Entwicklung standardisierter Kartuschendesigns und intuitiver Softwareschnittstellen für die Optimierung des Betriebs und der Dateninterpretation von entscheidender Bedeutung sein.
Da unser Verständnis biologischer Systeme immer differenzierter wird, werden Werkzeuge wie OptiDrop, die Mikrofluidik, Optik und Elektronik nahtlos integrieren, für die Entschlüsselung ihrer Feinheiten unverzichtbar sein. Durch die Bereitstellung einer zugänglichen und vielseitigen Plattform für die Einzelzellanalyse mit hohem Durchsatz stattet OptiDrop Forscher und Kliniker mit einem leistungsstarken Werkzeug aus, um neue Fragen zu stellen, bestehende Paradigmen in Frage zu stellen und bahnbrechende Entdeckungen in sinnvolle Auswirkungen auf die Praxis umzusetzen.
a Die OptiDrop-Plattform besteht aus einem mikrofluidischen Chip mit einem Öl- und Wassereinlass zur Bildung von Tröpfchen an der Flussfokussierungsstelle. Die wässrige Phase ist in Tröpfchen eingekapselt und fließt anschließend durch die optische Abfragestelle (Einschub), die von einer Reihe optischer Faserrillen flankiert wird, die um den zentralen Kanal herum angeordnet sind. Die Rillen auf dem Chip werden verwendet, um die optischen Fasern in festgelegten Winkelpositionen unterzubringen, was eine effektive Tröpfchenbeleuchtung mit dem einfallenden Laserlicht und die Sammlung von Streulicht- und Fluoreszenzsignalen ermöglicht, wenn das Tröpfchen den Lichtstrahl passiert. Der Glasfaserausgang wird zur Erkennung in ein PMT eingekoppelt. Die TTL-Impulszählungen von jedem PMT werden von einem FPGA-Chip mit einem Impulszähler integriert und als rohe Signalintensitätsspitzendaten aufgezeichnet. Die Rohdaten können weiter analysiert werden, um Fluoreszenzintensitäten der interessierenden Zellen zu identifizieren oder zu messen. b Auf dem Tisch montiertes Gerät mit einem Fußlineal zur Waage sowie einem Live-Datenstrom-Anzeigebildschirm und Spritzenpumpen. (Bild: Microsystems & Nanoengineering, CC BY 4.0) Die Kerninnovation von OptiDrop liegt in der strategischen Positionierung optischer Fasern rund um den mikrofluidischen Kanal. Während jedes Tröpfchen den Abfragepunkt passiert, wird es von einem Laser beleuchtet und erzeugt Streu- und Fluoreszenzsignale. Diese optischen Signale werden effizient von im 45°-Winkel angeordneten Fasern gesammelt und dann an separate Detektoren weitergeleitet. Maßgeschneiderte Elektronik digitalisiert die Signale in Echtzeit und ermöglicht so eine sofortige Visualisierung und Analyse des optischen Profils jedes Tröpfchens.
Um die Leistung von OptiDrop zu validieren, charakterisierten die Forscher zunächst seine Empfindlichkeit und seinen Dynamikbereich mithilfe standardisierter Fluoreszenzfarbstoffe. Beeindruckend ist, dass das Gerät Farbstoffkonzentrationen von nur 1 Nanomolar erkennen konnte und damit mit den Nachweisgrenzen herkömmlicher Instrumente mithalten konnte, während es nur einen Bruchteil des Probenvolumens benötigte. Darüber hinaus skalierte die von OptiDrop gemessene Fluoreszenzintensität linear über einen weiten Konzentrationsbereich und gewährleistete so eine genaue und zuverlässige Quantifizierung.
Anschließend demonstrierten die Forscher die Fähigkeiten von OptiDrop zur Partikelanalyse mithilfe von Mikrokügelchen unterschiedlicher Größe und Fluoreszenzintensität als Zellmimetika. Die Plattform konnte die Perlen anhand ihrer physikalischen Abmessungen und optischen Eigenschaften leicht unterscheiden. Bemerkenswert ist, dass OptiDrop selbst in einer heterogenen Mischung aus schwach und hell fluoreszierenden Perlen jede Subpopulation genau identifizierte und aufzählte. Dies unterstreicht die Robustheit des Systems bei der Analyse komplexer biologischer Proben mit unterschiedlichen Zelltypen.
Um den Nutzen der Plattform für eine biologisch relevante Anwendung zu demonstrieren, führte das Team einen Live-Cell-Assay durch, bei dem die Oberflächenexpression von Proteinen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) auf Immunzellen untersucht wurde. MHC-Moleküle sind entscheidende Regulatoren der Immunantwort gegen Krankheitserreger und abnormale Zellen und machen ihre Expressionsniveaus zu wertvollen Biomarkern. Durch die Nutzung fluoreszierend markierter Antikörper ermöglichte OptiDrop den gleichzeitigen Nachweis von MHC-Klasse-I- und -II-Proteinen auf einzelnen, in Tröpfchen eingekapselten Zellen. Die Stimulation der Zellen mit Interferon-Gamma, einem immunstimulierenden Zytokin, löste die erwartete Hochregulierung der MHC-Expression aus, die von der OptiDrop-Plattform empfindlich quantifiziert wurde.
Die Entwicklung von OptiDrop markiert einen bedeutenden Schritt in Richtung Demokratisierung modernster Einzelzellanalysefunktionen. Durch die Überwindung der Kosten- und Komplexitätsbarrieren, die die Einführung der Tröpfchen-Mikrofluidik behindert haben, macht diese innovative Plattform leistungsstarke zelluläre Abfragewerkzeuge für ein breiteres Spektrum von Forschern und Klinikern zugänglich. Aufgrund seiner Erschwinglichkeit, Benutzerfreundlichkeit und Robustheit eignet es sich gut für den routinemäßigen Einsatz in biomedizinischen Forschungslabors und Point-of-Care-Diagnoseumgebungen.
Die Einsatzmöglichkeiten von OptiDrop sind umfangreich und weitreichend. Im Bereich der Krankheitsüberwachung könnte es die hochempfindliche Erkennung seltener Biomarker ermöglichen und so eine nicht-invasive Frühdiagnose und Beurteilung des Behandlungserfolgs erleichtern. Die Integration in Arbeitsabläufe zur Einzelzellsequenzierung kann eine direkte Korrelation visueller Phänotypen mit Genexpressionsprofilen ermöglichen und so ein umfassenderes Verständnis der Zellzustände ermöglichen. Darüber hinaus machen das geschlossene Design der Plattform und die Fähigkeit, klinische Proben schnell zu verarbeiten, sie besonders attraktiv für Tests auf Infektionskrankheiten und andere zeitkritische diagnostische Anwendungen.
Obwohl OptiDrop einen erheblichen Fortschritt darstellt, gibt es noch Raum für weitere Optimierung und Erweiterung seiner Fähigkeiten. Eine Erhöhung des Durchsatzes durch die Ermöglichung schnellerer Tröpfchenflussraten und die Erzeugung kleinerer Tröpfchen könnte die Effizienz und Skalierbarkeit verbessern. Durch die Integration aktiver Sortierfunktionen könnten Benutzer bestimmte interessierende Subpopulationen anhand ihrer optischen Signaturen isolieren und so nachgelagerte molekulare Analysen ermöglichen. Darüber hinaus wird die Entwicklung standardisierter Kartuschendesigns und intuitiver Softwareschnittstellen für die Optimierung des Betriebs und der Dateninterpretation von entscheidender Bedeutung sein.
Da unser Verständnis biologischer Systeme immer differenzierter wird, werden Werkzeuge wie OptiDrop, die Mikrofluidik, Optik und Elektronik nahtlos integrieren, für die Entschlüsselung ihrer Feinheiten unverzichtbar sein. Durch die Bereitstellung einer zugänglichen und vielseitigen Plattform für die Einzelzellanalyse mit hohem Durchsatz stattet OptiDrop Forscher und Kliniker mit einem leistungsstarken Werkzeug aus, um neue Fragen zu stellen, bestehende Paradigmen in Frage zu stellen und bahnbrechende Entdeckungen in sinnvolle Auswirkungen auf die Praxis umzusetzen.
– Michael ist Autor von drei Büchern der Royal Society of Chemistry:
Nano-Gesellschaft: Grenzen der Technologie überschreiten,
Nanotechnologie: Die Zukunft ist winzig und
Nanoengineering: Die Fähigkeiten und Werkzeuge, die Technologie unsichtbar machen
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Nanowerk LLC
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