Nanobot-Synthese

Nanobots wurden wie zuvor beschrieben hergestellt³³. Kurz gesagt, MSNPs wurden mit einer modifizierten Stöber-Methode synthetisiert⁴¹, Reaktion von Triethanolamin (35 g), hochreinem Wasser (20 ml) und Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB; 570 mg) bei 95 °C für 30 Minuten unter Rühren. Anschließend wurde tropfenweise Tetraethylorthosilikat (1.5 ml) zugegeben; Die Mischung wurde 2 Stunden lang bei 95 °C reagieren gelassen und die resultierenden MSNPs durch Zentrifugation gesammelt und in Ethanol gewaschen (dreimal, 2,500).g, 5 Minuten). Um die CTAB-Matrize zu entfernen, wurden MSNPs 1.8 Stunden lang in saurem Methanol (30 ml HCl, 24 ml Methanol) unter Rückfluss gehalten. Anschließend wurden die MSNPs durch Zentrifugation gesammelt und dreimal in Ethanol (2,500 ml) gewascheng, 5 min) vor dem Einbau der Aminmodifikation durch Zugabe von APTES (6 µl pro mg MSNP) zu MSNPs (1 mg ml).^-1) in einer 70 %igen ethanolischen Lösung bei 70 °C unter kräftigem Rühren für 1 h. MSNPs-NH₂ wurden gesammelt und dreimal in Ethanol und dreimal in Wasser durch Zentrifugation gewaschen (dreimal 1,150).g, 5 Minuten). MSNPs-NH₂ wurden in PBS in einer Konzentration von 1 mg ml resuspendiert^-1 und einem Gesamtvolumen von 900 µl und mit Glutaraldehyd (100 µl) für 2.5 h bei Raumtemperatur aktiviert. Die aktivierten MSNPs-NH₂ wurden gesammelt und dreimal durch Zentrifugation in PBS gewaschen (1,150).g, 5 min), resuspendiert in einer Ureaselösung (3 mg ml^-1) und heterobifunktionales PEG (1 μg PEG pro mg 5 kDa HS-MSNPs-NH₂) in PBS und reagierte 24 Stunden lang bei Raumtemperatur. Die resultierenden Nanobots wurden dann gesammelt und dreimal in PBS durch Zentrifugation (1,150°C) gewascheng, 5 min), bevor sie in einer Dispersion von AuNPs resuspendiert werden, die wie zuvor beschrieben hergestellt wurde⁵¹, 10 Minuten lang reagieren lassen und gründlich durch Zentrifugieren waschen (dreimal, 1,150).g, 5 Minuten).

Hydrodynamische Größenverteilung und Oberflächenladung der MSNPs, MSNPs-NH₂Nanobots und AuNP-dekorierte Nanobots wurden mit einem dynamischen Lichtstreusystem von Wyatt Mobius bzw. einem Malvern Zetasizer bestimmt. In allen Fällen betrug die Konzentration 20 µg ml^-1 und Erfassungszeit 5 s, mit drei Durchläufen pro Experiment. Es wurden drei Messungen pro Partikelart durchgeführt.

Synthese von FITC-MSNPs

Eine Mischung aus FITC (2 mg), Ethanol (5 ml) und APTES (400 µl) wurde hergestellt und 30 Minuten lang gerührt. Dann wurde das zuvor beschriebene Protokoll für die MSNP-Synthese befolgt, mit der Ausnahme, dass wir Tetraethylorthosilicat (1.25 ml) tropfenweise in Kombination mit der FITC-APTES-Mischung (250 µl) hinzufügten. Die Funktionalisierungsschritte zum Erhalt FITC-markierter Nanobots waren wie oben beschrieben.

Synthese von AuNPs

AuNPs wurden mit einer beschriebenen Methode synthetisiert³³. Kurz gesagt, alle Materialien wurden mit frisch zubereitetem Königswasser gereinigt, gründlich mit Wasser gespült und an der Luft getrocknet. Anschließend eine 1 mM AuCl₄ Die Lösung wurde unter Rühren in einem Rundkolben, der in ein Rückflusssystem integriert war, bis zum Siedepunkt erhitzt. Anschließend wurden 10 ml Natriumcitratlösung (30.8 mM) zugegeben und die Lösung 20 Minuten lang gekocht, was zu einer roten Farbe führte. Anschließend ließ man die Lösung unter Rühren eine Stunde lang auf Raumtemperatur abkühlen. Die resultierenden AuNPs wurden im Dunkeln gelagert und die Charakterisierung erfolgte mittels Transmissionselektronenmikroskopie.

Enzymatische Aktivität

Enzymatische Aktivität von Nanobots, ¹⁸F-Nanobots und ¹³¹I-Nanobots wurden mit Phenolrot gemessen. Dazu werden 2 µl Nanobots (1 mg ml) benötigt^-1) wurden in eine 96-Well-Platte gegeben und mit 200 µl verschiedener Harnstofflösungen (0, 50, 100, 200 mM) in 1.1 mM Phenolrot gemischt. Die Absorption bei 560 nm wurde über die Zeit bei 37 °C gemessen.

Bewegungsdynamik von Nanobots durch optische Mikroskopie

Optische Videos von Nanobots wurden mit einem Leica Thunder-Mikroskop in Verbindung mit einer Hamamatsu-Hochgeschwindigkeits-CCD-Kamera und einem ×1.25-Objektiv aufgenommen. Hierzu wurden die Nanobots zentrifugiert und in 50 µl PBS (Endkonzentration 20 mg ml) resuspendiert^-1). Dann wurde eine Petrischale mit 3 ml PBS oder einer 300 mM Harnstofflösung (in PBS) gefüllt und unter dem Mikroskop beobachtet. Ein 5 µl Tropfen mit Nanobots (20 mg ml^-1) wurde dann in die mit Flüssigkeit gefüllte Petrischale gegeben und Videos wurden mit 25 Bildern pro Sekunde aufgenommen. Die Intensitätsverteilungen der Videopixel in ROIs wurden in 15-Zoll-Intervallen mit der ImageJ-Software analysiert.

Radiomarkierung von Nanobots mit [¹⁸F]F-PyTFP

Synthese von [¹⁸F]F-PyTFP

[¹⁸F]F-PyTFP wurde in einem Neptis xSeed-Modul (Optimized Radiochemical Applications) nach einer zuvor beschriebenen Methode synthetisiert³³.

Synthese von ¹⁸F-markierte Nanobots

Nanobots wurden mit [ gekennzeichnet¹⁸F]F-PyTFP, basierend auf einem zuvor etablierten Verfahren mit geringfügigen Modifikationen³³. Kurz gesagt, 200 µl Nanobot-Lösung (1 mg ml^-1) wurde zentrifugiert (10 min, 13,853g), resuspendiert in 10 µl PBS (1 mM, pH 8) und inkubiert mit 4 µl [¹⁸F]F-PyTFP in Acetonitril (ca. 37 MBq) für 35 min bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation wurde die Reaktionsmischung mit Wasser (200 µl) verdünnt und durch Zentrifugation (5 Minuten, 13,853 µl) gereinigtg). Das resultierende Pellet wurde dann dreimal mit Wasser gespült, bevor es in einem Dosiskalibrator (CPCRC-25R, Capintec) gemessen wurde. Die radiochemische Ausbeute wurde als Verhältnis zwischen der in den Nanobots nach dem Waschen vorhandenen Radioaktivitätsmenge und der anfänglichen Radioaktivitätsmenge berechnet. Die radiochemische Reinheit nach der Reinigung betrug ≥99 %, bestimmt durch Radiodünnschichtchromatographie (Radio-TLC) unter Verwendung von iTLC-SG-Chromatographiepapier (Agilent Technologies) und Dichlormethan und Methanol (2:1) als stationäre bzw. mobile Phase. TLC-Platten wurden mit einem TLC-Lesegerät (MiniGITA, Raytest) analysiert.

Stabilität von ¹⁸F-Nanobots

Die Stabilität von ¹⁸F-markierte Nanobots wurden unter Verwendung der folgenden Medien bestimmt: (1) 300 mM Harnstoff, (2) Wasser und (3) Urin von tumortragenden Tieren. ¹⁸F-markierte Nanobots (10 µl) wurden mit der entsprechenden Lösung (100 µl) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden Nanobots und Überstand durch Zentrifugation getrennt und gesammelt und die Radioaktivität in einem Dosiskalibrator (CPCRC-25R) gemessen.

Radiomarkierung von Nanobots mit ¹³¹I

Die Radioiodierung von Urease-Nanobots wurde durch Inkubation von Nanobots mit injizierbarem [¹³¹I]NaI-Lösung (925 MBq ml^-1; GE HealthCare). Kurz gesagt, 400 µl Urease-Nanobot-Lösung (1 mg ml^-1) wurde zentrifugiert (13,853g, 5 min), resuspendiert in 100 µl PBS (10 mM, pH 7.4) und inkubiert mit 25 µl oder 185 µl injizierbarem [¹³¹I]NaI (ca. 42.55 bzw. 277.5 MBq) für 30 min, abhängig von der gewünschten Endaktivität. Nach der Inkubation wurde die Reaktionsmischung durch Zentrifugation (13,853) gereinigtg, 5 Minuten). Der resultierende Niederschlag wurde dreimal mit Wasser (100 µl) gewaschen. Die Radioaktivität im Überstand und im Niederschlag wurde mit einem Dosiskalibrator (CPCRC-25R) bestimmt und beide Fraktionen wurden mittels Radio-TLC analysiert ¹⁸F-Nanobots.

Entwicklung von Tiermodellen

Die Mäuse wurden gemäß der Richtlinie 2010/63/UE des Europäischen Rates und internen Richtlinien gehalten und behandelt. Alle experimentellen Verfahren wurden von der CIC biomaGUNE-Ethikkommission und den örtlichen Behörden (Diputación Foral de Guipuzcoa, PRO-AE-SS-276) genehmigt. Die Bildanalyse (sowohl PET als auch MRT) erfolgte blind hinsichtlich der Gruppenverteilung der Tiere.

Das orthotope Mausmodell für Blasenkrebs wurde durch intravesikale Verabreichung von MB49-Zellen (Mauskarzinom-Blasenzelllinie) an weibliche C57BL/6JRj-Mäuse (8 Wochen alt, Janvier) erstellt. Für Experimente zur Bestimmung der Tumorakkumulation (vier Gruppen; Details unten) wurden sechs Tiere pro Gruppe geimpft, wie mithilfe einer Präzisionsanalyse bestimmt, mit den folgenden Annahmen: erforderliche Präzision: 20 %; erwartete Standardabweichung, ±20 %; Vertrauen, 95 %; Tierverlust: 20 %. Für therapeutische Wirksamkeitsexperimente (sechs Gruppen; Details unten) wurden zehn Tiere pro Gruppe eingeschlossen, wie anhand eines einseitigen Student berechnet t-Test, Differenz zwischen zwei unabhängigen Mittelwerten, mit den folgenden Annahmen: Nullhypothese, die Behandlung hat keinen Einfluss auf das Tumorwachstum; α, 0.05; 1 − β, 0.95; Standardabweichung, ±50 %; erwartete Unterschiede zwischen Gruppen: 50 %; Tierverlust: 20 %. Da der Versuch aus betrieblichen Gründen in zwei Ansätzen durchgeführt wurde, wurde in beiden Ansätzen jeweils eine Kontrollgruppe mitgeführt (Tab 2), und dann wurden alle Tiere gepoolt. Zur Tumorbildung wurden Mäuse durch Inhalation von 3 % Isofluran in reinem O anästhesiert₂ und durch 1.0–1.5 % Isofluran in 100 % O aufrechterhalten₂. Dann wurde die Blase entleert und chemische Läsionen am Urothel durch intravesikale Instillation von 50 µl Poly-l-Lysin (Sigma-Aldrich) durch einen 24-Gauge-Katheter für 15 Minuten. Anschließend wurde die Blase erneut entleert und MB49-Zellen (10⁵ Zellen) in DMEM mit hohem Glucosegehalt (100 µl) wurden 1 Stunde lang instilliert, bevor der Katheter entfernt und die Blase durch eine Bauchmassage entleert wurde. Während der gesamten Experimente wurden die Mäuse überwacht und gewogen, um ihre Gesundheit und ihr Wohlergehen zu überwachen. Ein menschlicher Endpunkt wurde angewendet, wenn der Gewichtsverlust 20 % überstieg oder auf der Grundlage klinischer Symptome, gemäß den Kriterien des zuständigen Tierarztes.

Verfolgung der Tumorgröße

MRT-Studien wurden 7 und 14 Tage nach der Tumorinduktion mit einem 7 T Bruker BioSpec USR 70/30-Scanner (Bruker BioSpin) durchgeführt, der mit einem BGA-12S-Gradienteneinsatz von 440 mT m ausgestattet war^-1 und ein 112/086 QSN-Resonator (T12053V3) für Hochfrequenz¹⁴ Übertragung und eine Rattenhirnoberflächenspule (T11205V3) für den HF-Empfang (beide arbeiten bei 300 MHz). Die Tiere wurden mit Isofluran betäubt (4 % zur Einleitung und 1.5 % zur Aufrechterhaltung in einer 50 %igen Sauerstoffatmosphäre).₂/50 % N₂ Mischung) und auf eine MR-kompatible Halterung gestellt. Körpertemperatur und Atemfrequenz wurden kontinuierlich mit einem MR-kompatiblen Überwachungsgerät (Modell 1030 SA, Small Animal Instruments) überwacht, das an ein Lufterhitzersystem für kleine Nagetiere angeschlossen war, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Nach der Aufnahme von Referenzbildern wurde eine diffusionsgewichtete Bildgebungssequenz auf Spin-Echo-Basis verwendet, um Tumore abzubilden, wobei die folgenden Parameter verwendet wurden: Echozeit (T_E) = 22.3 ms, Wiederholungszeit (T_R) = 2,500 ms, n = 2 Mittelwerte, ein A0-Bild (Basalbild mit b = 0 s mm^-2) und ein DW-Bild, das unter Verwendung von Diffusionsgradienten in der (1, 0, 0)-Richtung mit einer Gradientendauer aufgenommen wurde δ = 4.5 ms und eine Gradiententrennung Δ = 10.6 ms, ergibt b = 650 s mm^-2, ein 16 × 16 mm² Sichtfeld, Bildmatrixgröße von 160 × 160 Punkten, 20 aufeinanderfolgende Schichten mit einer Dicke von 0.5 mm (keine Lücke, aufgenommen im Interleaved-Modus) und eine Bandbreite von 192.9 Hz pro Pixel. Um Tumore sichtbar zu machen, wurden die Bilder mit der ImageJ-Software nachbearbeitet, wobei die mit einem Diffusionsgradienten aufgenommenen Bilder geteilt wurden (b = 650 s mm^-2) von denen, die ohne (b = 0 s mm^-2) und Anwenden eines 3D-Gauß-Filters (σ_x = σ_y = σ_z = 0.7) zum Ergebnis. Tumore wurden manuell abgegrenzt, um ihr Volumen zu bestimmen.

In-vivo-Bioverteilung

Am Tag 15 nach der Tumorinduktion wurden die Mäuse randomisiert in vier Gruppen eingeteilt, um eine homogene durchschnittliche Tumorvolumenverteilung zwischen den Gruppen zu erhalten. PET-CT-Scans (MOLECUBES β- und X-CUBE-Scanner) wurden 3 Stunden nach der intravesikalen Verabreichung von 100 µl aufgenommen ¹⁸F-BSA (Gruppen 1 und 2) oder ¹⁸F-Urease-Nanobots (Gruppen 3 und 4) in einer Konzentration von 200 µg ml^-1, wobei entweder Wasser (Gruppen 1 und 3) oder 300 mM Harnstoff in Wasser (Gruppen 2 und 4) als Vehikel verwendet werden (Tabelle 1). Zur Bildaufnahme wurden die Tiere mit einer Anästhesie (5 % Isofluran in reinem Sauerstoff) eingeleitet und in Rückenlage gebracht, bevor sie zur Blasenentleerung den Bauchbereich massierten. Unmittelbar danach das entsprechende ¹⁸F-markierte Nanobots (¹⁸F-BSA/¹⁸F-Urease in Wasser/Harnstoff) wurden durch einen 24-Gauge-Katheter in die Blase eingeträufelt und eine Stunde lang inkubiert, bevor der Katheter entfernt, die Blase entleert und die Mäuse sich von der Narkose erholen konnten. Bei t = 3 h nach der Verabreichung wurden die Tiere erneut betäubt und 10 min lang statische Ganzkörper-PET-Bilder aufgenommen, gefolgt von CT-Scans. PET-Bilder wurden unter Verwendung des 3D-Rekonstruktionsalgorithmus zur Erwartungsmaximierung geordneter Teilmengen mit Zufalls-, Streuungs- und Schwächungskorrekturen rekonstruiert. PET-CT-Bilder derselben Maus wurden mit dem PMOD-Bildverarbeitungstool mitregistriert und analysiert. Diagramme der Radioaktivitätskonzentration im Vergleich zur Zeit wurden erhalten, indem mit einem 3D-Konturwerkzeug ein interessierendes Volumen im oberen Blasenbereich erstellt und die Aktivität (zerfallskorrigiert) in Kilobecquerel pro Organ gemessen wurde. Die Ergebnisse wurden durch Anwendung eines Kalibrierungsfaktors korrigiert und dann durch das MRT-abgeleitete Tumorvolumen normalisiert.

Ex-vivo-Studien

Histopathologische Analysen

Nach Abschluss aller Bildgebungsarbeiten wurden ausgewählte Blasen (n = 3 pro Gruppe) von tumortragenden und gesunden Tieren wurden unter aseptischen Bedingungen entnommen und sofort in 4 % Formaldehyd fixiert. Anschließend wurden die Blasen in Paraffin eingebettet, bevor 2–3 µm große Schnitte zur Hämatoxylin-Eosin-Färbung entnommen wurden. Von allen Erkrankungen wurden repräsentative Bilder für die histopathologische Untersuchung erhalten.

ICP-MS-Analyse

Die Messungen wurden auf einem Thermo iCAP Q ICP-MS (Thermo Fisher Scientific) in Verbindung mit einem ASX-560 Autosampler (CETAC Tech) durchgeführt. Nach Abschluss aller Bildgebungsarbeiten wurden die Tiere getötet und ausgewählte Blasen (n = 2 pro Gruppe; vier Gruppen) gesammelt und in 1 ml HNO verdaut₃:HCl (4:1-Mischung). Die Dispersion wurde gekocht, bis sich die Organe vollständig aufgelöst hatten. Anschließend wurde die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und mittels ICP-MS analysiert, um die Au-Konzentration in jeder Probe zu bestimmen, wobei die Ergebnisse in Prozentsätze der injizierten Dosis pro Gramm Gewebe (%ID g) umgewandelt wurden^-1).

Immunhistochemie und konfokale Mikroskopie-Bildgebung

Für immunhistochemische Analysen erhielten tumortragende Tiere FITC-markierte Nanobots in Wasser oder 300 mM Harnstoff (n = 4 pro Gruppe), wie oben beschrieben, für PET-CT-Studien. Zusätzlich dienten tumortragende Tiere ohne Nanobots als Kontrollgruppe (n = 2). In allen Fällen wurden die Blasen gesammelt, eingefroren und in 10-µm-Schnitte geschnitten, die sofort 10 Minuten lang in 15 % Formaldehyd fixiert, mit 10 mM PBS gewaschen und dann in 50 mM NH inkubiert wurden₄Cl in PBS für 5 min, bevor erneut mit PBS gespült wird. Die Permeabilisierung wurde mit Methanol:Aceton (1:1) für 5 Minuten bei Raumtemperatur und 0.1 % Triton in PBS für 5 Minuten durchgeführt. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Proben 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einer Lösung aus 0.5 % BSA und 15 % Tween in PBS gesättigt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit Maus-Anti-FITC (1:100, Abcam) in 5 % BSA inkubiert –0.5 % Tween. Die Schnitte wurden dreimal 10 Minuten lang mit 5 mM PBS gewaschen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit dem Sekundärantikörper Alex Fluor 647 Esel-Anti-Maus-IgG (Molecular Probes, Life Technologies, 1:1,000) in 5 % BSA – 0.5 % Tween inkubiert in PBS, erneut in PBS gewaschen (3 × 5 min) und mit einem ProLong Antifade-Kit mit 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; Molecular Probes, Life Technologies) montiert. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Leica STELLARIS 5-Mikroskop (UPV/EHU Scientific Park) mit identischen Einstellungen für alle Abschnitte aufgenommen: 10-fache Vergrößerung mit Kachelbildgebung und Stitching (typischerweise 4 × 5 Sichtfeld). Die Laserlinien- und Erkennungsfenster betrugen 405 nm und 440–503 nm für DAPI, 489 nm und 494–602 nm für den weißen FITC-Laser und 653 nm und 660–836 nm für den weißen Alexa647-Laser.

Optische Reinigung

Nach der Perfusion mit 4 % Paraformaldehyd und PBS wurden die Blasenproben entnommen und über Nacht bei 4 °C in 4 % Paraformaldehyd weiter fixiert und dann in eine 5-ml-Spritze mit 0.8 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt eingebettet, um einen zylindrischen Block zu bilden und eine einfache Reinigung zu ermöglichen Montage in der Quarzküvette. Der gesamte Block wurde schrittweise mit Methanol:H dehydriert₂O bei 4 °C (30 %:70 % für 1 h, 50 %:50 % für 1 h, 70 %:30 % für 1 h, 100 %:0 % für 1 h, dann 100 % Methanol über Nacht und noch einmal für 4 h) und schließlich in Benzylalkohol-Benzylbenzoat (BABB) als Lösung zur Anpassung des Brechungsindex für die Bildgebung eingetaucht. Für In-vitro-Vergleiche von grünen FITC-Nanobots mit kommerziellen roten Partikeln verwendeten wir rot fluoreszierende Silica-Nanopartikel von DiagNano (Creative Diagnostics), 1 µm Durchmesser, resistent gegen BABB-Clearing.

Autofluoreszenz und polarisierte sLS-Bildgebung

Die Lichtblattbildgebung wurde mit MacroSPIM durchgeführt, einem am IRB Barcelona entwickelten maßgeschneiderten System für die Bildgebung geklärter ganzer Organe^44,45. Kurz gesagt, Proben werden in einen Agaroseblock eingebettet, zusammen mit der Probe geklärt und in einer Quarzküvette abgebildet. Bei der Autofluoreszenzbildgebung wurden Laser mit 488, 561 oder 638 nm verwendet, die eine Beleuchtung durch eine achromatische Dublett-Zylinderlinse mit 50 mm Durchmesser (ACY254-050-A, Thorlabs) lieferten. Um Streifenartefakte zu reduzieren, wird das Lichtblatt mit einem Resonanzscanner SC-10 (EOPC) entlang eines 4f-Teleskops mit G322288322 100 mm achromatischen Dublettlinsen (QI Optic Photonics) geschwenkt. Die Autofluoreszenz des Gewebes wird durch Band- oder Langpass-Fluoreszenzfilter gesammelt und mit einer ORCA Flash v2-Kamera (Hamamatsu Photonics) aufgezeichnet. Die Bildaufnahme erfolgte bei ×9.6 mit einem ×8-Zoom, einem ×2-Objektiv und einer ×0.6-Tubuslinse. Das Lichtblatt wurde über das Sichtfeld abgeflacht, was eine axiale Auflösung von 5–6 µm ergab. Die 3D-Bildgebung erfolgte in Schritten von 2.5 µm. Die Bildgebung der gesamten Blase wurde in 2 × 3 oder 3 × 4 durchgeführt XY Kacheln, je nach Orgelgröße.

Die sLS-Bildgebung wurde erreicht, indem der Fluoreszenzfilter entfernt oder ein anderer Filter verwendet wurde, der den Laser durchlässt. Das Schwenken des Lichtblatts reduzierte das Laser-Speckle-Rauschen, was zu einer zeitlichen Mittelung der Laserkohärenz führte, wie zuvor gezeigt⁵². Die Ausrichtung der linearen Lichtblattpolarisation bei der Beleuchtung wurde durch Drehen einer Halbwellenplatte (AHWP05M-600, Thorlabs) vor dem Pivot-Scanner gesteuert. Das detektierte Signal wurde in der Polarisation unter Verwendung eines rotierenden linearen Polarisators (LPVISC100, Thorlabs) vor dem Filterrad bei der Detektion selektiert, was zu einem Intensitätsverlust von >50 % bei der Fluoreszenzdetektion führte. Während sich die sLS-Signalverteilung im Allgemeinen mit der Ausrichtung des Polarisators ändert, bleibt das Autofluoreszenzsignal des Gewebes von der Drehung des Polarisators unberührt. sLS liefert eine räumliche Auflösung von 2.4 ± 0.3 µm in BABB, was mit der Auflösung in der Fluoreszenzlichtblatt-Bildgebung vergleichbar ist (bestätigt durch Anpassen einer Gaußschen Funktion an die). XY Bildantwort eines einzelnen Teilchens, ergänzende Abb. 8l–m) und nahe an der theoretischen Auflösung in Luft (1.53 µm mit numerischer Apertur (NA) = 0.2 bei maximalem Makrozoom ×8).

Bildverarbeitung und 3D-Analyse

Die Bildverarbeitung, Segmentierung und Analyse von Lichtblattdatensätzen erfolgte mit ImageJ/Fiji, während Abb. 3 machen 4 wurden mit Imaris Viewer 9.9 generiert (https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer) und Zusatzvideo 3 wurde mit Imaris 9 generiert (https://imaris.oxinst.com/) (Bitplane, Oxford Instruments). Gekachelte Light-Sheet-Datensätze wurden mit MosaicExplorerJ zusammengefügt⁵³. Die 3D-Segmentierung des Blasengewebes wurde mithilfe benutzerdefinierter ImageJ/Fiji-Makros für die halbautomatische 3D-Annotation großer Volumina im virtuellen Modus durchgeführt. Kurz gesagt, ein erstes Skript, „Macro1“, lädt 3D-Bildstapel, ermöglicht dem Benutzer die Anmerkung von ROIs in mehreren Ebenen und interpoliert die ROIs automatisch, um 3D-Masken zu generieren und zu exportieren. ROIs wurden alle 15 Ebenen (alle 37.5 µm) gezeichnet, um eine gute Segmentierungskontinuität zu ermöglichen und gleichzeitig Anmerkungen auf ein angemessenes Minimum zu beschränken. Ein zweites Skript, „Macro2“, führt die mathematischen oder booleschen Operationen Ebene für Ebene aus, ohne die gesamten Stapel in den Speicher zu laden, entweder zwischen 3D-Masken oder zwischen einer 3D-Maske und den Originaldaten, und speichert das Ergebnis als neuen Stapel. Alle Masken wurden durch Kommentieren von Autofluoreszenzbildern generiert.

Sowohl Tumor- als auch gesunde Gewebeoberflächenschichten (Abb. 3) wurden mit Fijis Zauberstab und Lasso-Werkzeugen auf der Blasenhöhle in einer Maske abgegrenzt. Durch den Aufruf dieser ersten Iteration BC1 erweitern nachfolgende Makro1-Durchläufe diese 3D-Kontur dann automatisch um einen definierten Pixelbetrag, um neue Maskeniterationen BC2, BC3 usw. mit zunehmenden Erweiterungen zu erhalten. Die erste Schicht, die sowohl Tumor- als auch gesundes Gewebe enthält, Maske L1, wird durch Subtrahieren der Maske BC1 von BC2 usw. erhalten, was L2 und L3 als konzentrische Schichten ergibt. Das dem Hohlraum am nächsten gelegene Tumorvolumen wurde durch Annotieren des Tumors mit Zauberstab- und Lassowerkzeugen ermittelt, um eine Maske T1 zu erstellen, während die gesunde Urothel-3D-Schicht separat in Maske U1 erfasst wurde. Subtrahiert man U1 von L1, erhält man die Oberflächenschicht des Tumors usw.: L2 − U1, L3 − U1. Umgekehrt erhält man die erste Schicht des Urothels durch Subtraktion von T1 von L1. Alle Schichten in Abb. 3 wurden auf eine Dicke von 33 µm festgelegt.

Die gleichen Makros und Verfahren (ImageJ-Zauberstab, digitale Erosion von 500 µm usw.) wurden verwendet, um den inneren Teil des Blasengewebes abzugrenzen und zu segmentieren und dann das innere Gewebevolumen der Blase abzuschätzen (Abb. 4, Einzelheiten siehe oben). Histogramme der Streusignalintensität wurden in Fidschi durch Kombination von Streusignal und Maske erstellt.

RNT verwenden ¹³¹Ich-Nanobots

Zwischen dem 8. und 15. Tag nach der Tumorimplantation wurden die Tiere in sechs Gruppen (Gruppen 1–6) eingeteilt, wobei versucht wurde, in allen Gruppen ähnliche durchschnittliche Tumorvolumina zu erreichen (Tabelle 2). Für die Experimente wurden die Tiere mit einer Narkose (5 % Isofluran in reinem O) eingeleitet₂) und in Rückenlage gelagert, bevor die Blase durch Massieren der Bauchregion entleert wird. Unmittelbar danach 100 µl der entsprechenden Behandlung in einer Konzentration von 400 µg ml^-1 (Tabelle 2) wurde mit einem 24-Gauge-Katheter in die Blase instilliert. Behandlung und Vehikel (Wasser oder Harnstoff) blieben 1 Stunde lang in der Blase, bevor der Katheter entfernt wurde. Die Blase wurde durch eine Bauchmassage wieder entleert und die Mäuse erholten sich von der Anästhesie in ihren Käfigen, wobei 24 Stunden nach der Behandlung Tierkäfig-Sägemehl ausgetauscht wurde, um radioaktive Kontamination zu entfernen.

Therapeutische Wirksamkeit durch MRT bestimmt

An jeder Maus wurden zwei MRT-Studien durchgeführt: (1) zwischen dem 7. und 14. Tag nach der Tumorinokulation, um die Tiere zufällig in Gruppen einzuteilen und das anfängliche Tumorvolumen (vor der Behandlung) zu messen; (2) zwischen dem 16. und 21. Tag nach der Tumorimpfung (Nachbehandlung), um die therapeutische Wirksamkeit zu bewerten. Die MRT wurde je nach Verfügbarkeit mit 7 T Bruker BioSpec- und 11.7 T Bruker BioSpec-Scannern (beide mit ParaVision 7-Software) durchgeführt. Dies hatte keinen Einfluss auf die Ergebnisse, da das externe Feld für die anatomische Bildgebung nicht kritisch ist¹⁴. Bildgebungsexperimente wurden mit den gleichen Bildgebungsparametern und der gleichen Verarbeitung wie oben erläutert durchgeführt (Verfolgung der Tumorgröße). Im Fall des 11.7 T-Scanners bestand der Aufbau aus einer Mausherz-Oberflächenspule für den Empfang und einer volumetrischen Spule für die Übertragung. Die Tumorvolumina in jedem Schnitt wurden aus manuell gezogenen interessierenden Volumina bestimmt, die den Tumorbereich abdecken.

statistische Analyse

In PET-Bildgebungsstudien werden Prozentsätze der injizierten Dosis (% ID) und der injizierten Dosis pro Tumorvolumen (% ID cm) angegeben^-3) wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA verglichen. Unterschiede zwischen Gruppen wurden mithilfe des Mehrfachvergleichstests von Tukey ermittelt. NTV im RNT-Abschnitt wurde von a erhalten t-Test ungepaarter Werte. Es wurde davon ausgegangen, dass die Datenverteilung normal sei, dies wurde jedoch nicht offiziell getestet. Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism v.8 durchgeführt.

Berichtzusammenfassung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie im Nature Portfolio-Berichtszusammenfassung mit diesem Artikel verlinkt.

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• Quelle: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01577-y