Ethik-Erklärung

Alle iPSC-Linien wurden zuvor nach unterzeichneter Einverständniserklärung aus Hautbiopsie-Fibroblasten gewonnen und im Rahmen einer ethischen Genehmigung des South Wales Research Ethics Committee (WA/12/0186) und des South Central Berkshire Research Ethics Committee (REC10/H0505/71) gesammelt. in der James Martin Stem Cell Facility der Universität Oxford nach standardisierten Protokollen. Die iPSC-Linien wurden alle bereits veröffentlicht (siehe unten und Ergänzungstabelle). 1).

iPSC-Kultur

Drei iPSC-Linien stammen von drei verschiedenen ALS-Patienten, die eine HRE tragen C9orf72 und als Kontrolle eine isogene Linie, die zuvor durch CRISPR/Cas9-Genombearbeitung unter Verwendung einer homologiegesteuerten Reparatur erzeugt wurde¹⁸In dieser Studie wurden vier geschlechts- und altersangepasste gesunde Kontroll-iPSC-Linien verwendet. Alle iPSC-Linien wurden zuvor veröffentlicht und umfassend charakterisiert (Einzelheiten zu Demografie und Charakterisierung finden Sie in der Ergänzungstabelle). 1). iPSC wurden in mTeSR™1 (85850, StemCell Technologies) auf Geltrex™ (A1413302, ThermoFisher) mit täglichen Mediumwechseln kultiviert. Die Zellen wurden mit EDTA (0.5 mM) passagiert und expandiert, um konsistente, gefrorene Zellbestände für die Studie zu erzeugen (kryokonserviert in 50 % mTeSR™1, 30 % fötalem Rinderserum mit embryonalen Stammzellen (16141002, Merck), 10 % KnockOut™ DMEM ( 10829018, ThermoFisher), 10 % DMSO (D2650, Merck)) mit maximal 3 aufeinanderfolgenden Passagen während des Experiments und wurde mit dem MycoAlert negativ auf Mykoplasmen getestet^TM Mykoplasmen-Nachweiskit (Lonza).

Differenzierung von iPSC-abgeleiteten Motoneuronen

iPSC wurden mithilfe eines zuvor veröffentlichten Protokolls von MNs unterschieden³⁹. Kurz gesagt, die neuronale Induktion wurde unter Verwendung von DMEM-F12/Neurobasal 50:50, ergänzt mit N2 (1X), B27 (1X), 2-Mercaptoethanol (1X), Antibiotikum-Antimykotikum (1X, alle ThermoFisher), Ascorbinsäure (0.5 μM) durchgeführt. , Verbindung C (1 μM, beide Merck) und Chir99021 (3 μM, R&D Systems). Nach zwei Tagen in der Kultur wurden Retinsäure (1 μM, Merck) und Smoothened Agonist (500 nM, R&D Systems) hinzugefügt. Nach weiteren 2 Tagen wurden Verbindung C und Chir99021 entfernt. Am Tag in vitro (DIV)18 wurden die Zellen erneut auf Polyethylenimin (PEI, 0.07 %, Merck) und Geltrex™ (ThermoFisher) oder PDL (Sigma-Aldrich)/Laminin (R&D Systems)/Fibronektin (Corning) ausplattiert Medium zusätzlich ergänzt mit BDNF (10 ng/ml), GDNF (10 ng/ml), Laminin (0.5 μg/ml, alle ThermoFisher) und DAPT (10 μM, R&D Systems). Drei Tage später wurde das Medium wie unten beschrieben auf Mikroglia-Medium umgestellt und die MNs wurden entweder gemeinsam mit Mikroglia kultiviert oder in Monokultur gehalten. Alle 2–4 Tage wurde ein halber Mediumwechsel durchgeführt.

Differenzierung iPSC-abgeleiteter Mikroglia-Vorläufer

iPSC wurden wie zuvor beschrieben zu Makrophagen-/Mikroglia-Vorläufern differenziert^15,40. Kurz gesagt, die Bildung von Embryoidkörpern (EB) wurde durch die Aussaat von iPSC in Aggrewell 800-Wells (STEMCELL Technologies) in mTeSR™1, ergänzt mit BMP4 (50 ng/ml), VEGF (50 ng/ml, beide Peprotech) und SCF (20), induziert ng/ml, Miltenyi Biotec). Nach vier bis sieben Tagen mit täglichen ¾ Mediumwechseln wurden EBs in T175-Flaschen überführt und in X-VIVO15 (Lonza), ergänzt mit Interleukin-3 (25 ng/ml, R&D Systems), MCS-F (100 ng/ml), differenziert ), GlutaMAX (1X, beide ThermoFisher) und 2-Mercaptoethanol (1X). Wöchentlich wurde frisches Medium hinzugefügt. Nach ungefähr zwei Monaten wurden die Vorläufer durch Sammeln des Überstands geerntet, durch ein Zellsieb (40 μM, Falcon/Greiner) gegeben und entweder in Monokultur oder Co-Kultur zu Mikroglia differenziert, wie unten beschrieben.

Differenzierung iPSC-abgeleiteter Mikroglia

Mikroglia-Vorläufer wurden auf PEI (0.07 %) und Geltrex™ oder PDL/Laminin/Fibronektin unter Verwendung unseres zuvor charakterisierten Mikroglia-Mediums ausplattiert¹⁷ bestehend aus Advanced DMEM-F12 (ThermoFisher), GlutaMAX (1X), N2 (1X), Antibiotikum-Antimykotikum (1X), 2-Mercaptoethanol (1X), Interleukin-34 (100 ng/ml, Peprotech/BioLegend), BDNF ( 10 ng/ml), GDNF (10 ng/ml) und Laminin (0.5 μg/ml). Mikroglia wurden etwa 14 Tage lang differenziert, wobei alle 2–4 Tage die Hälfte des Mediums gewechselt wurde, und für die RNA/Protein-Extraktion gesammelt oder für Tests verwendet.

Co-Kultur von iPSC-abgeleiteten Motoneuronen und Mikroglia

Co-Kulturen wurden wie zuvor beschrieben unter Verwendung der HC-2b-Linie erzeugt (Ergänzungstabelle). 1), um MNs zu erzeugen¹⁷. Kurz gesagt, drei Tage nach der letzten erneuten Ausplattierung differenzierender MNs (DIV21) wurden Mikroglia-Vorläufer geerntet. MNs wurden mit PBS gespült und in Mikroglia-Medium resuspendierte Mikroglia-Vorläufer wurden im Verhältnis 1:1 zu den MNs in jede Vertiefung gegeben. Die Kokulturen wurden mindestens 14 Tage lang aufrechterhalten, wobei alle 2–4 Tage die Hälfte des Mediums gewechselt wurde. In ausgewählten Experimenten wurde der direkte Kontakt der beiden Zelltypen durch Ausplattieren von Mikroglia in Gewebekultureinsätzen (0.4 µm Porengröße, 83.3932.040, Sarstedt) verhindert.

Priming von Mikroglia mit LPS- und MMP9-Inhibitor-Behandlung

Bei Mikroglia-Monokulturen wurde das gesamte Medium abgesaugt und LPS (100 ng/ml, L4391, Merck) im Mikroglia-Medium 48 Stunden lang zugegeben. Die Kontrollvertiefungen erhielten nur frisches Mikroglia-Medium. Unter ausgewählten Bedingungen wurden wiederholte LPS-Behandlungen am Tag 0, 2 und 4 durchgeführt. Für Co-Kulturen wurden LPS-Behandlungen auf DIV25 begonnen und 10 Tage lang durchgeführt. Die Hälfte des Mediums wurde abgesaugt und durch LPS in Mikroglia-Medium (Endkonzentration: 100 ng/ml) ersetzt, wobei die Hälfte des Mediums zusätzlich mit LPS-haltigem Mikroglia-Medium auf DIV29 und 33 ausgetauscht wurde. In zusätzlichen Experimenten wurden LPS-Behandlungen auf DIV25 und begonnen 20 Tage lang durchgeführt, wobei die Hälfte der Medien jeden zweiten Tag gewechselt wird. Für diese Experimente wurden BDNF und GDNF aus den Kulturmedien entfernt. Um MMP9 zu hemmen, wurden die Kulturen gleichzeitig mit LPS (100 ng/ml) und MMP9-Inhibitor I (MMP9i, 3 μM, 444278, Merck) oder DMSO in gleichen Konzentrationen (0.3 %) als Vehikelkontrolle behandelt.

Priming von Mikroglia mit TNF/IL1B

Das gesamte Medium wurde aus Mikroglia-Monokulturen abgesaugt und TNF (50 ng/ml) und IL1B (20 ng/ml, beide Peprotech) im Mikroglia-Medium 48 Stunden lang zugegeben. Die Kontrollvertiefungen erhielten nur frisches Mikroglia-Medium.

Behandlung von MNs mit rhMMP9 und MMP9-Inhibitor

MNs wurden mit rekombinantem aktivem humanem MMP9 (rhMMP9, 30 ng/ml, PF024-5UG, Merck) und MMP9i (3 μM, 444278, Merck) oder DMSO in gleichen Konzentrationen (0.3 %) als Vehikelkontrolle behandelt. Die Behandlungen wurden an DIV21 und DIV25 durchgeführt und die MN-Lebensfähigkeit wurde durch MTS-Assay an DIV29 bestimmt.

Live-Bildgebung der Phagozytose und Quantifizierung

Nicht stimulierte und mit LPS vorbereitete (100 ng/ml für 48 Stunden) Mikroglia-Monokulturen wurden 1 Minuten lang mit Hoechst in Live Cell Imaging Solution (10,000:10, ThermoFisher) gefärbt. pHrodo™ Red Zymosan Bioparticles™ (P35364, ThermoFisher) in Live Cell Imaging Solution (50 µg/ml) wurden in jede Vertiefung gegeben und Bilder wurden nach 150 Minuten mit einem EVOS™ XL Core Cell Imaging System (ThermoFisher) aufgenommen, das mit einem 10x ausgestattet war Zielsetzung. Unter ausgewählten Bedingungen wurden die Zellen zusätzlich mit den Phagozytose-/Abbauinhibitoren Cytochalasin D (10 μM, C2618, Merck), Bafilomycin A1 (1 μM, 1334, R&D Systems) oder DMSO (Vehikel) mit einer einstündigen Vorbehandlung behandelt. Die Quantifizierung wurde automatisch mithilfe eines Analysemakros in Fidschi durchgeführt und die Fläche der Phagozytosepartikel pro Zelle wurde durch Division der Fläche der internalisierten Phagozytosepartikel durch die Anzahl der Hoechst-positiven Mikroglia ermittelt.

Patch-Clamp-Elektrophysiologie

Die Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt¹⁷. Gesunde Kontroll-MNs auf DIV 42–46 in Co-Kultur mit gesunden Kontroll- oder C9orf72-ALS-Patienten-Mikroglia wurden in einer extrazellulären Lösung gehalten, die 167 mM NaCl, 2.4 mM KCl und 1 mM MgCl enthielt₂, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES und 2 mM CaCl₂ auf einen pH-Wert von 7.4 und 300 mOsm eingestellt. Elektroden mit Spitzenwiderständen zwischen 7 und 12 MΩ wurden aus Borosilikatglas (0.86 mm Innendurchmesser; 1.5 mm Außendurchmesser) hergestellt. Der Elektrode wurde eine intrazelluläre Lösung zugesetzt, die 140 mM K-Gluconat, 6 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM MgATP und 0.5 mM Na enthielt₃GTP, eingestellt auf pH 7.3 und 290 mOsm. Die Datenerfassung erfolgte mit einem Multiclamp 700B-Verstärker, Digidata 1550 A und der ClampEx 6-Software. Serienwiderstand (R_s) wurde bei <30 MΩ gehalten. Spannungsgesteuerte Kanalströme wurden an einer Spannungsklemme gemessen, wobei Neuronen 250 ms lang mit einem Impuls von –140 mV vorgepulst wurden und eine 10-mV-Schrittspannung von –70 mV bis +70 mV angelegt wurde. Induzierte Aktionspotentiale (APs) wurden an der Stromzange aufgezeichnet, die Neuronen wurden bei –70 mV gehalten und 15 Stromstufen von 10 pA wurden von –10 pA bis 130 pA angelegt. Spannungsgesteuerte Kanalströme und Eigenschaften induzierter Aktionspotentiale (Rheobase, maximale APs, APs über Rheobase) wurden mit Clampfit 10.3 (pCLAMP Software Suite, Molecular Devices) quantifiziert. Die maximalen APs wurden quantifiziert, indem die Anzahl der APs im Sweep mit dem längsten Zug bestimmt wurde. AP-Dauer und -Amplitude wurden in Matlab R2022a (MathWorks) unter Verwendung des ersten Aktionspotentials quantifiziert, das von jedem Neuron aufgezeichnet wurde.

MEA-Aufnahmen

Insgesamt wurden 2–15-minütige Aufzeichnungen der neuronalen Aktivität für Co-Kulturen in 48-Well-MEA-Platten (M768-tMEA-48B, Axion BioSystems) unter Verwendung des Maestro-Systems (Axion Biosystems) erhalten. Die Analyse wurde mit der AXIS-Software v2.5.2 (Axion BioSystems) mit SD > 5.5 als Nachweisschwelle durchgeführt. Die mittlere Feuerungsrate pro Well wurde durch Mittelung aller aktiven (>1 Spitze/Minute) Elektroden pro Well berechnet.

RNA-Isolierung und RT-qPCR

Die RNA wurde mit einem RNAeasy Mini Plus-Kit (Qiagen) extrahiert und gleiche Mengen an RNA (100 ng) wurden mit dem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (ThermoFisher) revers in cDNA transkribiert. Quantitative Echtzeit-PCR wurde mit Fast SYBR™ Green Master Mix (ThermoFisher) unter Verwendung eines LightCycler® 480 PCR-Systems (Roche) und den in der Ergänzungstabelle aufgeführten Primern (ThermoFisher) durchgeführt 3. Alle Kits wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Quantifizierung der relativen Fold-Genexpression erfolgte mithilfe der 2^–∆∆Ct Methode mit Normalisierung auf die TBP Referenzgen (TBP Ct-Bereich 0.5) und die mittlere Genexpression der Kontrollmikroglia für jedes Experiment.

RNA-Sequenzierung

Drei gesunde Kontroll- und drei von C9orf72-ALS-Patienten stammende iPSC-Linien wurden in Mikroglia differenziert, mit drei unabhängigen Differenzierungen pro Linie. Die RNA wurde wie oben beschrieben extrahiert. Alle RNA-Proben wiesen RIN-Werte von mindestens 8.5 auf. Anschließend wurden die Probenvorbereitung und die bioinformatische Analyse wie zuvor beschrieben durchgeführt¹⁷. Kurz gesagt, die Proben wurden vor der Bibliotheksvorbereitung auf 100 ng normalisiert. Die Anreicherung polyadenylierter Transkripte und die strangspezifische Bibliotheksvorbereitung wurden mit dem NEBNext Ultra II mRNA-Kit (NEB) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Paired-End-Sequenzierung (Leselänge: 150 Basenpaare) wurde unter Verwendung einer NovaSeq6000-Plattform (Illumina, NovaSeq 6000 S2/S4-Reagenzienkit, v1.5, 300 Zyklen) durchgeführt und ergab eine Rohlesezahl von mindestens 30 M Lesevorgängen pro Probe . Paired-End-Reads wurden dem menschlichen GRCh38.p13-Referenzgenom zugeordnet (https://www.gencodegenes.org) mit HISAT2 v2.2.1⁴¹. Die Zähltabelle wurde mit FeatureCounts v2.0.1 erstellt⁴². Die Normalisierung der Zählungen und die Analyse der differentiellen Expression wurden mit DESeq2 v1.28.1 durchgeführt⁴³ in RStudio 1.4.1103, einschließlich des biologischen Geschlechts im Modell und mit der Benjamini-Hochberg-Methode zur mehrfachen Testkorrektur. Die drei verschiedenen Differenzierungen pro Bedingung wurden in einem Datenpunkt zusammengefasst, sofern nicht anders angegeben, wenn das biologische Geschlecht und die Differenzierungsreplikation in das Modell einbezogen wurden. Die explorative Datenanalyse wurde nach einer varianzstabilisierenden Transformation der Zähltabelle unter Verwendung der Hauptkomponentenanalyse durchgeführt. Protokoll₂ Faltwechsel (log₂ fc) Die Schrumpfung wurde mit dem „normalen“ Ansatz durchgeführt. Gene mit | Protokoll₂ fc| > 0.5 und angepasst p-Wert < 0.05 wurden als differentiell exprimierte Gene (DEG) definiert. Die Daten wurden mit Anmerkungen aus der Gene Ontology-Datenbank unter Verwendung von ClusterProfiler v3.16.1 interpretiert⁴⁴. Wir haben die Signalweganreicherung analysiert, indem wir eine Überrepräsentationsanalyse (ORA) für alle DEGs und eine Gene-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) für das gesamte Transkriptom durchgeführt haben, sortiert nach Protokoll₂fc, unter Verwendung der Standardeinstellungen im ClusterProfiler für ORA und GSEA (angepasst p-Wert < 0.05 nach der Benjamini-Hochberg-Methode).

Immunfluoreszenz

Auf Deckgläsern kultivierte Zellen wurden mit 2 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 2 Minuten bei Raumtemperatur (RT) vorfixiert und dann mit 4 % PFA in PBS für weitere 15 Minuten bei RT fixiert. Nach der Permeabilisierung und Blockierung mit 5 % Eselserum und 0.2 % Triton X-100 in PBS für 1 Stunde bei RT wurden die Deckgläser mit den in der Ergänzungstabelle aufgeführten Primärantikörpern inkubiert 2, verdünnt in 1 % Eselserum und 0.1 % Triton X-100 in PBS, bei 4 °C EIN. Nach drei Wäschen mit PBS-0.1 % Triton oder Abcam). Anschließend wurden die Deckgläser zweimal jeweils 100 Minuten lang mit PBS-5 % Triton X-488 gewaschen und 568 Minuten lang mit DAPI (647 µg/ml, Sigma-Aldrich) in PBS inkubiert. Nach einem weiteren 1-minütigen Waschschritt mit PBS-1000 % Triton X-0.1 wurden die Deckgläser mit ProLong™ Diamond, Gold oder Glass Antifade Mountant (ThermoFisher) auf Objektträger montiert. Die konfokale Mikroskopie wurde mit einem LSM 100, LSM 5 (beide Zeiss) oder Fluoview FV1 (Olympus) Mikroskop durchgeführt.

Analyse mikroglialer Auswirkungen

Für jedes Deckglas wurden vier bis fünf Z-Stapelbilder (Z-Intervall: 1 μm) zufällig ausgewählter Gesichtsfelder mit 60-facher Vergrößerung aufgenommen und in Fidschi Projektionen mit maximaler Intensität erstellt. Um die Verzweigung IBA1-positiver Mikroglia in Monokultur und Co-Kultur zu analysieren, wurden das Zellvolumen, der Verzweigungsindex, die durchschnittliche Verzweigungslänge und die Anzahl der Verzweigungspunkte automatisch mithilfe von 3DMorph bestimmt, wie an anderer Stelle beschrieben¹⁹.

Quantifizierung der TDP-43-Fehllokalisierung in Mikroglia

Für jedes Deckglas wurden vier bis fünf Z-Stapelbilder zufällig ausgewählter Gesichtsfelder mit 60-facher Vergrößerung aufgenommen und in Fidschi Projektionen mit maximaler Intensität erstellt. Die mittleren Intensitätswerte für TDP-43 im Zellkern und Zytoplasma wurden blind bestimmt, wobei das DAPI- und das IBA1-Signal zur Identifizierung der Kern- bzw. Zytoplasmagrenzen verwendet wurden. Anschließend wurde das Verhältnis von zytoplasmatischem zu nuklearem TDP-43 berechnet.

Quantifizierung der Mikroglia-Marker-Expression in Mikroglia-Monokulturen

Für jedes Deckglas wurden drei Z-Stapelbilder zufällig ausgewählter Gesichtsfelder mit 40-facher Vergrößerung aufgenommen und in Fidschi Projektionen mit maximaler Intensität erstellt. Die Anzahl der DAPI-positiven Kerne und IBA1⁺/DAPI⁺ und TMEM119⁺/DAPI⁺ Die Anzahl der Zellen wurde mithilfe eines Makros automatisch pro Ansichtsfeld für jede Zeile quantifiziert.

Quantifizierung der Anzahl und Verhältnisse von Mikroglia und Motoneuronen in Co-Kultur

Für jedes Deckglas wurden drei bis fünf Z-Stapelbilder zufällig ausgewählter Gesichtsfelder mit 10- oder 40-facher Vergrößerung aufgenommen und in Fidschi Projektionen mit maximaler Intensität erstellt. Für Mikroglia wurde mithilfe eines Makros ein automatischer Schwellenwert auf den IBA1-Kanal angewendet, um eine Maske zu erstellen, und die Anzahl der Mikrogliazellen wurde für jedes Sichtfeld bestimmt, indem die Anzahl der DAPI-positiven Kerne innerhalb der IBA1-Maske mithilfe der Analysefunktion gezählt wurde Funktion der Teilchen. Für MNs wurde ein automatischer Schwellenwert auf den TUJ1-Kanal angewendet, um eine Maske zu erstellen, und die Anzahl der Neuronen wurde für jedes Sichtfeld bestimmt, indem die Anzahl der DAPI-positiven Kerne innerhalb der TUJ1-Maske mithilfe der Funktion „Partikel analysieren“ gezählt wurde. Um das Mikroglia:MN-Verhältnis zu berechnen, wurde die Anzahl der Mikrogliazellen durch die MN-Zahl dividiert. Zur Beurteilung des MN-Überlebens nach langfristiger LPS-Exposition wurde die absolute MN-Zahl auf den Mittelwert der Kontrolllinien normalisiert, um das relative MN-Überleben unter Berücksichtigung von Chargeneffekten zwischen Differenzierungen nach Langzeitkultur zu bestimmen.

Quantifizierung der apoptotischen Markerexpression in Co-Kultur

Für jedes Deckglas wurden fünf Z-Stapelbilder zufällig ausgewählter Gesichtsfelder mit 40-facher Vergrößerung aufgenommen. Es wurden Projektionen maximaler Intensität erstellt. Mithilfe eines Makros wurde ein automatischer Schwellenwert auf den TUJ1-Kanal angewendet, um eine Maske zu erstellen, und die Expression des apoptotischen CC3-Markers innerhalb von Neuronen wurde für jedes Sichtfeld bestimmt, indem die Fläche des CC3-Signals innerhalb der TUJ1-Maske mithilfe der Analyse quantifiziert wurde Funktion der Teilchen. Um Chargeneffekte zwischen Differenzierungen zu berücksichtigen, wurde die Faltungsänderung im Ausdruck durch Normalisierung der absoluten Messungen auf den Mittelwert der Kontrolllinien generiert.

Quantifizierung des Neuritenwachstums in Co-Kultur

Bei 60-facher Vergrößerung wurden für jedes Deckglas vier bis fünf Z-Stapel zufällig ausgewählter Sichtfelder erhalten, die Neuriten zeigen, aber neuronale Somas vermeiden. In Fidschi wurden Projektionen maximaler Intensität erstellt. Mithilfe eines Makros wurde ein automatischer Schwellenwert auf die TUJ1-Färbung angewendet und das Neuritenwachstum für jedes Sichtfeld durch Messung der Fläche TUJ1-positiver Neuriten pro Sichtfeld mithilfe der Funktion „Partikel analysieren“ in Fidschi bestimmt.

Analyse der neuronalen Synaptophysin-Expression

Für jedes Deckglas wurden vier bis fünf Z-Stapelbilder zufällig ausgewählter Gesichtsfelder mit 60-facher Vergrößerung aufgenommen. In Fidschi wurden Projektionen maximaler Intensität erstellt. Mithilfe eines Makros wurde ein automatischer Schwellenwert auf die Synaptophysin-Färbung angewendet, um punktförmige Strukturen zu analysieren, und die Anzahl und Fläche der Synaptophysin-Partikel wurde für jedes Sichtfeld mithilfe der Funktion „Partikel analysieren“ in Fidschi bestimmt.

RNAscope

RNA-Foci wurden mit dem RNAscope Multiplex Fluorescent v2 Assay (323100, ACD) gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. Kurz gesagt, mit 4 % PFA fixierte iPSC-Mikroglia wurden nacheinander jeweils 50 Minute lang mit 70 %, 100 % und 1 % Ethanol dehydriert und bei –20 °C gelagert. Nach der Rehydratisierung mit 100 %, 70 % und 50 % Ethanol wurden die Zellen mit 0.1 % Tween-20 in PBS, Wasserstoffperoxid und Protease III (Verdünnungsverhältnis 1:15) jeweils 10 Minuten lang inkubiert, mit dazwischen liegenden PBS-Waschvorgängen. Sonden, die auf die (G₄C₂)_n und C₄G₂)_n Erweiterungen (ACD, 884351-C2 und 884361-C2) wurden zu separaten Deckgläsern hinzugefügt und 2 Stunden lang inkubiert, gefolgt von Amplifikations- und Entwicklungsschritten gemäß dem Standardprotokoll. Die sequentielle ICC wurde durch Inkubation mit primärem Antikörper gegen IBA1 (1:200, 019-19741, Wako Fujifilm) für 2 Stunden bei RT und dann gemäß dem oben beschriebenen Immunfluoreszenzprotokoll durchgeführt.

Quantifizierung der Bildung von RNA-Foci in Mikroglia

Für jedes Deckglas wurden fünf Z-Stapelbilder zufällig ausgewählter Gesichtsfelder mit 40- oder 63-facher Vergrößerung aufgenommen und in Fidschi Projektionen mit maximaler Intensität erstellt. Die Anzahl der Foci-positiven Zellen und die Anzahl der Foci pro Foci-positiven Kern wurden durch manuelles Zählen bestimmt.

MTS-Lebensfähigkeitstest

In ausgewählten Experimenten wurde die MN-Lebensfähigkeit mithilfe des CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS, G3580, Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die Plattenablesungen wurden nach 90–120-minütiger Inkubation mit Testreagenzien durchgeführt.

Messung der Freisetzung von Zytokinen/Chemokinen und Neurofilamenten

Kulturüberstände wurden gesammelt und 1200 Minuten lang bei 4 xg und 10 °C zentrifugiert. Gepoolte Proben wurden mit dem Proteome Profiler Human XL Cytokine Array (ARY022B) oder dem Protease/Protease Inhibitor Array (ARY025, beide R&D Systems) gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert. Das Signal wurde auf einem ChemiDoc visualisiert^TM MP-Bildgebungssystem (Bio-Rad) und analysiert mit ImageStudioLite v5.2.5 (LI-COR). Darüber hinaus wurden die Human DPP4 (DC260B), MMP9 (DMP900), CXCL10 Quantikine ELISAs (DIP100) und das Active MMP9 Fluorokine E Kit (F9M00, alle R&D Systems) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Freisetzung menschlicher leichter Neurofilament-Ketten (NfL) wurde mithilfe eines Meso Scale Discovery (MSD)-Assays (K1517XR-2) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.

Proteinextraktion

Die Zellen wurden mit PBS gespült und 100–200 μl kalter RIPA-Puffer (ThermoFisher) mit Complete ergänzt^TM Protease-Inhibitor-Cocktail und PhosSTOP^TM Phosphatase-Inhibitor (beide Merck) wurden in jede Vertiefung gegeben. Zur Homogenisierung der Lysate wurden pro Probe 10 1s-Impulse mit motorbetriebenen Stößeln appliziert. Nach 30-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Proben bei 12,000 U/min und 4 zentrifugiert^o15 Minuten bei °C gehalten und die Überstände wurden bei –80 °C gelagert. Die Quantifizierung der Proteinkonzentration erfolgte mit dem Pierce^TM Bicinchoninsäure-Protein-Assay-Kit (ThermoFisher) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Anschließend wurden Proteinproben in definierten Konzentrationen (0.3–1.0 μg/μL) durch Verdünnung in destilliertem Wasser, NuPAGE, hergestellt^TM Ladepuffer und NuPAGE^TM Probenreduktionsmittel (beide ThermoFisher). Anschließend erfolgte eine 95-minütige Inkubation bei 5 °C, um die Proben zu denaturieren und zu reduzieren.

Western-Blot

5–20 μg jeder Probe und Spectra Multicolour Broad Range Protein Ladder oder PageRuler™ Prestained Protein Ladder (beide ThermoFisher) wurden auf vorgefertigtes NuPAGE geladen^TM Bis-Tris 4–12 % Gradientengele (ThermoFisher). Die Proben wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter Verwendung von NuPAGE aufgetrennt^TM MES-Laufpuffer (ThermoFisher) bei 50–130 V. Anschließend wurden die Proteine ​​20 Minuten lang bei 25–7 V unter Verwendung eines iBlot 2 Dry-Blotting-Systems (beide ThermoFisher) auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Nach einer einstündigen Blockierung mit 5 % Milch oder BSA in TBS/0.1 % Tween-20 (TBS-T, ThermoFisher) bei RT wurden die Membranen mit den in der Ergänzungstabelle aufgeführten Primärantikörpern inkubiert 4 verdünnt in 3 %iger Milch oder BSA in TBS-T bei 4 °C über Nacht. Die Membranen wurden dreimal 7 Minuten lang mit TBS-T gewaschen und dann 1 Stunde lang mit entsprechenden Meerrettichperoxidase (HRP)-gekoppelten Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur inkubiert. Die folgenden HRP-gekoppelten Sekundärantikörper (alle 1:5000) wurden verwendet: Schaf-Anti-Maus-HRP (NA931V), Esel-Anti-Kaninchen-HRP (NA934V, beide GE Healthcare), Esel-Anti-Ziege-HRP (PA1-28664, ThermoFisher) . Die Membranen wurden erneut dreimal 7 Minuten lang mit TBS-T gewaschen und dann eine Minute lang mit verstärkter Chemilumineszenzlösung (Millipore) inkubiert. Der ChemiDoc^TM Zur Visualisierung des Signals wurde ein MP-Bildgebungssystem verwendet. Die Bandenintensitäten wurden mit Fiji v1.53q quantifiziert⁴⁵ und auf die Housekeeping-Gene β-Actin oder GAPDH und die mittlere Expression der Kontrollen für jedes Experiment normalisiert. Nach der Entwicklung wurden die Membranen zweimal 5 Minuten lang mit TBS-T gewaschen, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation mit Restore^TM PLUS Stripping-Puffer (ThermoFisher). Nach zwei weiteren 5-minütigen Waschgängen mit TBS-T wurden die Membranen blockiert und wie oben beschrieben mit neuen Primärantikörpern inkubiert.

Analyse der Poly(GA)/(GP)-Expression

Die Zellen wurden in RIPA-Puffer (Sigma-Aldrich), ergänzt mit 2× Complete Mini, EDTA-freiem Proteaseinhibitor-Cocktail (Merck) und 2 % SDS (ThermoFisher), lysiert und durch Ultraschallbehandlung homogenisiert. Nach Zentrifugation bei 17,000 × g Bei 16 ° C für 20 Minuten wurde der Proteingehalt der Überstände wie in den ergänzenden Methoden beschrieben bestimmt. Die Proben wurden auf die gleiche Konzentration (0.6–1.0 mg/ml) eingestellt und der MSD-Immunoassay wurde im Singleplex unter Verwendung von SECTOR-Platten mit 96 Vertiefungen (MSD) durchgeführt, um die Poly(GA)/(GP)-Expression wie zuvor beschrieben zu quantifizieren²⁰. Kurz gesagt, die Platten wurden mit unmarkierten Anti-Poly(GP)- oder Anti-Poly(GA)-Antikörpern beschichtet. Nach dem Blockieren wurden die Proben mit 45 µg Protein pro Vertiefung für den Poly(GP)-Immunoassay und mit 27 µg Protein für Poly(GA) geladen. Als Detektoren wurden biotinylierte Anti-Poly(GP)- und Anti-Poly(GA)-Antikörper verwendet, gefolgt von sulfomarkiertem Streptavidin (Meso Scale Discovery, R32AD). Die Platten wurden mit dem MSD-Lesepuffer (Meso Scale Discovery, R92TC) unter Verwendung des MSD Sector Imager 2400 gelesen. Die Signale entsprechen der Intensität des emittierten Lichts bei elektrochemischer Stimulation der Testplatte. Vor der Analyse wurde der Durchschnittswert eines Kalibrators, der kein Peptid enthielt, von jedem Messwert abgezogen. Negative Signale wurden auf „0“ gesetzt.

Statistik und Reproduzierbarkeit

Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurde keine statistische Methode verwendet. Sofern das Versuchsdesign dies zuließ, waren die Forscher während der Analysen hinsichtlich der Zuordnung blind. Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism 9 durchgeführt. Es wurden keine Daten aus den Analysen ausgeschlossen. Daten aus mehreren Linien und Differenzierungen wurden zusammengefasst, um die Gesamtwirkung der zu vergleichen C9orf72 HRE versus Kontrollen. Vergleiche zweier Gruppen wurden durch zweiseitige ungepaarte t-Tests und Mehrfachgruppenvergleiche durch einfaktorielle oder zweifaktorielle ANOVA mit entsprechenden Post-hoc-Tests durchgeführt, wie in den Legenden der Abbildungen angegeben. Die Anzahl der unabhängigen Experimente und Linien ist in jeder Abbildungslegende angegeben. Die Daten werden als einzelne Datenpunkte dargestellt und bedeuten ± SEM. Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn P < 0.05 (*P <0.05; ** **.P <0.01; ***.P < 0.001; ****P < 0.0001; kA: nicht signifikant). Boxplots zeigen den Median (Mittellinie), die oberen und unteren Quartile (Boxgrenzen), den 1.5-fachen Interquartilbereich (Whisker) und Ausreißer (Punkte). Zum Plotten der Daten wurden GraphPad Prism 9 oder RStudio 1.4.1103 verwendet. Die Endmontage der Figuren erfolgte mit Adobe Illustrator 25.4.1.

Berichtzusammenfassung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie im Nature Portfolio-Berichtszusammenfassung mit diesem Artikel verlinkt.

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• Quelle: https://www.nature.com/articles/s41467-023-41603-0