Unternehmen, die Ausrüstung, Reagenzien und/oder Verbrauchsmaterialien bereitstellen: Abcam, Cambridge, MA; ACD Labs, Toronto, CA; Acris Antibodies, Inc), San Diego, CA; Advanced Bioscience Resources, Inc (ABR), Rockville, MD; Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornien; Alpco Diagnostics, Salem, NH; Applied Biosystems, Foster City, CA; BD Pharmingen, San Jose, CA; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX; BioAssay Systems, Hayward, CA; Cambridge Isotope Laboratories, Tewksbury, MA; Biotime, Inc, Alameda, CA; Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, NY; Carolina Liquid Chemistries, Corp., Winston-Salem, NC; Charles River Laboratories International, Inc, Wilmington, MA; Chenomx, Inc, Alberta, Kanada; Cole-Parmer, Court Vernon Hills, IL; DiaPharma, West Chester Township, OH; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA; Gatan, Inc, Pleasanton, CA; Illumina, San Diego, Kalifornien; Ingenuity, Redwood City, CA; Life Technologies Corp., Grand Island, NY; Leica, Washington, D.C.; LifeSpan Biosciences, Inc, Seattle, A; Molecular Devices, Sunnyvale, CA; Olympus Scientific Solutions Americas Corp., Waltham, MA; PhoenixSongs Biologicals (PSB), Branford, CT; Polysciences, Inc, Warrington, PA; Qiagen, Germantown, MD; R&D Systems, Minneapolis, MN; RayBiotech, Norcross, GA; Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland; Santa Cruz Biotechnology, Inc), Dallas, TX; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; Sofregen, Medford, MA; Takara, Otsu, Japan; Tousimis Research Corp., Rockville, MD; Triangle Research Labs (TRL), Research Triangle Park, NC; Umetrics, Umea, Schweden; Varian Medical Systems, Inc), Palo Alto, CA; Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornien; VWR Scientific, Radnor, PA.

Ethische Aussagen fassen zusammen, wie die Tiere gehalten wurden. Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den anerkannten Institutional Animal Care and Use Committees der North Carolina State University (NCSU) in Raleigh und der University of North Carolina (UNC) in Chapel Hill durchgeführt und folgten somit den in der Erklärung dargelegten Grundsätzen von Helsinki für alle experimentellen Untersuchungen an Menschen oder Tieren. Alle in Tierversuchen verwendeten Verfahren und diejenigen, die die Verwendung von menschlichem Gewebe beinhalten, wurden von den Ausschüssen des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und des Institutional Review Board (IRB) beider Institutionen genehmigt: der UNC und dem College of Veterinary Medicine der NCSU . Die IACUC-Zulassungsnummern lauten 16-316.0 und 17-225.0. Studien für menschliche Zellen in diesem Projekt wurden vom IRB-Komitee bewertet und erhielten die IRB-Genehmigungsnummer 97-1063.

Menschliche Proben enthalten Informationen zu jeder Probe sowie allgemeine Informationen für alle Proben und werden in früheren Studien detailliert bereitgestellt:^39,41,42

Fötales Lebergewebe wurde von einer akkreditierten Agentur (Advanced Biological Resources, San Francisco, CA) von Feten im Gestationsalter zwischen 18 und 22 Wochen bereitgestellt, die durch freiwillige Schwangerschaftsabbrüche gewonnen wurden. Das Forschungsprotokoll wurde vom IRB für Humanforschungsstudien der UNC überprüft und genehmigt. Alle Proben wurden auf verschiedene Krankheitserreger untersucht und nur solche, die keine dieser Krankheitserreger enthielten, wurden für die Forschungsstudien akzeptiert.

Postnatale Lebern wurden von Leichenspendern von Neugeborenen, Kindern und Erwachsenen und über Organspendeprogramme von UNOS gewonnen. Die für diese Studien verwendeten Proben wurden als normal angesehen und wiesen keine Hinweise auf Krankheitsprozesse auf, auch nicht nach einem Screening auf Krankheitserreger. Für die Verwendung der Lebern zu Forschungszwecken wurde die Einverständniserklärung der nächsten Angehörigen eingeholt, die Protokolle erhielten die IRB-Genehmigung und die Verarbeitung erfolgte im Einklang mit der Guten Herstellungspraxis.

Die Schweineproben stammten von Tieren, die in den Einrichtungen des College of Veterinary Medicine der North Carolina State University (NCSU, Raleigh, NC) gehalten wurden. Einige von ihnen dienten als Wirte oder als Spender für Zellen. In diesen Einrichtungen wurden Operationen, Autopsien und die Sammlung aller biologischen Flüssigkeiten und Gewebe durchgeführt.

Die für die Transplantate verwendeten Schweine-Wirte waren eine Mischung aus sechs verschiedenen Rassen: eine sechsfache Kreuzung bestehend aus Yorkshires, Large Whites, Landrassen (von den Sauen), Durocs, Spots und Pietrans (von den Ebern). Dieser äußerst heterogene genetische Hintergrund ist insofern wünschenswert, als er den heterogenen genetischen Konstitutionen menschlicher Populationen entspricht⁶⁵. Die Wirtstiere waren alle weiblich, etwa 6 Wochen alt und etwa 15 kg schwer.

Grün fluoreszierendes Protein (GFP)⁺ Es wurden transgene Schweinespender etabliert, die ein H2B-Histon-eGFP-Transgen trugen. Die GFP⁺ Spendertiere wurden durch Kreuzung eines transgenen H2B-GFP-Ebers mit einer Wildtyp-Jaube durch standardmäßige künstliche Befruchtung gewonnen⁶⁶. Das Modell wurde über die CRISPR-Cas9-vermittelte homologiegesteuerte Reparatur (HDR) von IRES-pH2B-eGFP in den endogenen β-Actin (ACTB)-Locus entwickelt. Die transgenen Tiere zeigen eine ubiquitäre Expression von pH2B-eGFP in allen Geweben. Die Fusion des GFP mit H2B führt zur Lokalisierung des GFP-Markers am Nukleosom und ermöglicht eine klare Kernvisualisierung sowie die Untersuchung der Chromosomendynamik. Die Gründerlinie wurde umfassend und allgegenwärtig analysiert und die kernlokale Expression wurde bestätigt. Darüber hinaus konnte durch Züchtung eine Übertragung des H2B-GFP auf die nächste Generation nachgewiesen werden. Alle Tiere waren gesund und es wurden Mehrlingsschwangerschaften festgestellt, deren Nachkommen das erwartete Mendelsche Verhältnis für die Übertragung des pH2B-eGFP zeigten. Die männlichen Nachkommen wurden bei der Geburt genotypisiert, und diejenigen, die positiv auf das Transgen reagierten, wurden zur Gewebeentnahme und Isolierung von Spenderzellen auf humane Weise eingeschläfert.

Es wurde eine Genotypisierung von Schweinen durchgeführt. Für jedes Spender- und Empfängertier wurden die Schweine-Leukozytenantigen-Loci der Klasse I (SLA-I) und Klasse II (SLA-II) mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern amplifiziert, die zur Amplifikation bekannter Allele in diesen Regionen basierend auf der PCR entwickelt wurden -sequenzspezifische Primer-Strategie¹⁸. Das System besteht aus 47 diskriminierenden SLA-I-Primersätzen, die die SLA-1-, SLA-2- und SLA-3-Loci verstärken, und 47 diskriminierenden SLA-II-Primersätzen, die die DRB1-, DQB1- und DQA-Loci verstärken⁶⁷. Diese Primersätze wurden entwickelt, um Allele nach Gruppen zu differenzieren, die ähnliche Sequenzmotive aufweisen, und es wurde gezeigt, dass sie bekannte SLA-I- und SLA-II-Allele einfach und eindeutig erkennen können. Bei gemeinsamer Verwendung lieferten diese Primersätze effektiv einen Haplotyp für jedes getestete Tier und stellten somit einen Assay zur Verfügung, mit dem sich leicht ein übereinstimmender oder nicht übereinstimmender Haplotyp bei Spender- und Empfängertieren bestätigen lässt.

Operationen an den Schweinen wurden unter Anästhesie durchgeführt, die durch die Verabreichung einer Kombination aus Ketamin/Xylazin (jeweils 2–3 mg/kg Gewicht), intravenös injiziert, oder 20 mg/kg Ketamin plus 2 g/kg Xylazin IM eingeleitet und durch Isofluran in Sauerstoff aufrechterhalten wurde Die Verabreichung erfolgt über ein Gasanästhesiegerät mit geschlossenem Kreislauf. Bei Transplantationen an der Leber und bei allgemeinen chirurgischen Eingriffen wurden die Schweine in Rückenlage gelagert und der ventrale Bauch wurde vom Xyphoid bis zum Schambein abgeschnitten. Die Haut wurde aseptisch mit abwechselnd jodhaltigem Peeling und Alkohollösungen vorbereitet. Nach dem Betreten des Operationssaals wurde die Hautvorbereitung mit einer sterilen Technik wiederholt und der Bereich mit einer topischen Jodlösung bedeckt, bevor sterile Operationstücher angelegt wurden. Die Chirurgen verwendeten eine geeignete aseptische Technik. Es wurde ein mittlerer ventraler Schnitt durch die Haut, durch subkutanes Gewebe und durchgeführt Linea alba, beginnend am Schwertfortsatz und erstreckend nach kaudal 8–12 cm. Der linke Leberteil wurde freigelegt und ein 3 × 4.5 cm großes Patch-Transplantat wurde auf die ventrale Oberfläche der Leber aufgebracht und enthielt ein 1X Hyaluronan-Hydrogel (~60 Pa) mit eingebetteten BTSC-Organoiden und wurde auf den Träger gelegt, der 10X Hyaluronan-Hydrogel enthielt (~ 760 Pa); Das Pflaster wurde in direktem Kontakt auf die Oberfläche der Leberkapsel gelegt. Das Patch-Transplantat wurde mit 4–6 einfachen Einzelknopfnähten aus 4–0 Polypropylen an der Leber festgenäht. Die freiliegende Oberfläche des Transplantats wurde dann mit 2 ml 2X Hyaluronan-Hydrogel (~200–300 Pa) behandelt, einem Steifheitsgrad, der flüssig genug war, um es auf die Außenseite des Transplantats aufzutragen oder zu beschichten; es diente außerdem dazu, Adhäsionen von benachbarten Geweben zu minimieren. Nach der Platzierung des chirurgischen Transplantats wird die Linea alba wurde mit einer einfachen fortlaufenden Naht unter Verwendung von 0-PDS verschlossen. Der Linea wurde mit 2 mg/kg 0.5 % Bupivacain, IM, blockiert. Das Unterhautgewebe und die Haut wurden mit kontinuierlichen 2–0 PDS- bzw. 3–0 Monocryl-Nähten verschlossen. Auf die Hautoberfläche wurde Gewebekleber aufgetragen.

Für Transplantate an der Bauchspeicheldrüse wurde bei chirurgischen Eingriffen bei Schweinen ein Transplantat verwendet, das jede Größe haben kann, die den Abmessungen der Bauchspeicheldrüse entspricht. Zur Freilegung der Bauchspeicheldrüse wurden Haltenähte im absteigenden Zwölffingerdarm angebracht. Das Transplantat wurde auf dem Kopf der Bauchspeicheldrüse und neben dem Zwölffingerdarm platziert, wobei das weiche Hyaluronan-Hydrogel (~60 Pa) die Organoide in direktem Kontakt mit der Bauchspeicheldrüse enthielt und das steifere Hyaluronan-Hydrogel (~760 Pa) innerhalb der Seide lag Rückendeckung. Wir verwendeten Nähte an den vier Ecken (4–0 Prolene); die ersten beiden Ecknähte wurden im absteigenden Zwölffingerdarm platziert; Die anderen beiden wurden im Mesenterium und unter Vermeidung des Pankreasparenchyms platziert (um jegliche Neigung zur Autolyse durch die Bauchspeicheldrüse zu minimieren). Die seröse Oberfläche des Transplantats wurde dann mit 2X Hyaluronan-Hydrogel (~2–200 Pa) bedeckt, um Adhäsionen zu minimieren. Der Bauch wurde mit durchgehenden resorbierbaren Nähten (PDS) in den Linea-, Subkutan- und Subkutikularschichten verschlossen. Um Hautnähte zu vermeiden, wurde Gewebekleber auf die Haut aufgetragen.

Eine Immunsuppression war erforderlich, da die Transplantationen von den transgenen Schweinen auf die Wildtyp-Empfänger allogen waren. Die verwendeten Protokolle zur Immunsuppression wurden von anderen entwickelt^68,69. Alle Schweine erhielten zweimal täglich orale Dosierungen der Immunsuppressiva Tacrolimus (0.5 mg/kg) und Mycophenolat (500 mg), beginnend 24 Stunden vor der Operation. Die Medikamente wurden über den gesamten Versuchszeitraum kontinuierlich verabreicht. Diese könnten den Tieren leicht verabreicht werden, wenn sie mit ihrem Lieblingsfutter gemischt würden.

Die Isolierung normaler Gewebe erfolgte von neugeborenen Ferkeln und von älteren, 12 Wochen alten Schweinen. Neugeborene Ferkel wogen etwa 10 Pfund; die älteren Schweine, 12 Wochen alt, wogen etwa 50–60 Pfund. Die Schweine wurden durch Bolzenschuss-Euthanasie und anschließende Ausblutung der Halsschlagader getötet. Die Methode entspricht den empfohlenen Richtlinien der American Veterinary Medical Association für die Euthanasie bei Schweinen⁶⁵. Eine Auflistung der Spender, die für Gallengewebe von Ferkeln oder erwachsenen Schweinen verwendet wurden, finden Sie in der Ergänzungstabelle 4.

Alle Medien wurden steril filtriert (0.22 µm Filter) und vor der Verwendung im Dunkeln bei 4 °C aufbewahrt. Basalmedium und fötales Rinderserum (FBS) wurden von GIBCO/Invitrogen bezogen. Sämtliche Wachstumsfaktoren wurden von R&D Systems eingekauft. Alle anderen Reagenzien, mit Ausnahme der angegebenen, wurden von Sigma bezogen.

Zellwaschpuffer bestanden aus 500 ml Basalmedium (z. B. RPMI 1640; Gibco Nr. 11875-093), ergänzt mit 0.5 g Serumalbumin (Sigma, Nr. A8896-5G, fettsäurefrei), 10^-9 M Selen und 5 ml Antibiotika (Gibco Nr. 35240-062, AAS). Es wurde zum Waschen von Geweben und Zellen während der Verarbeitung verwendet.

Kollagenasepuffer bestand aus 100 ml Zellwaschlösung, ergänzt mit Kollagenase (Sigma # C5138), mit einer Endkonzentration von 600 U/ml (R1451 25 mg) für Gallenbaumgewebe (Gänge) und 300 U/ml (12.5 mg) für Organe ( z. B. Leber).

Kubotas Medium, ein vollständig definiertes, serumfreies Medium, das ursprünglich für Hepatoblasten entwickelt wurde⁷⁰, und sich dann für die Erhaltung von Gallenbaumstammzellen, Leberstammzellen und Pankreasstammzellen und Vorläufern als erfolgreich erwiesen (und sich später allgemein für alle untersuchten endodermalen Stammzellen/Vorläufer als erfolgreich erwiesen), wurde zur Herstellung von Zellsuspensionen, Organoiden usw. verwendet Hyaluronan-Hydrogele. Dieses Medium besteht aus einem beliebigen Basismedium (hier RPMI 1640) ohne Kupfer, niedrigem Kalziumgehalt (0.3 mM), 1 nM Selen, 0.1 % Serumalbumin (gereinigt, fettsäurefrei; Fraktion V), 4.5 mM Nikotinamid, 0.1 nM Zinksulfat-Heptahydrat, 5 µg/ml Transferrin/Fe, 5 µg/ml Insulin, 10 µg/ml High-Density-Lipoprotein und eine Mischung aus gereinigten freien Fettsäuren, die mit fettsäurefreiem, hochreinem Albumin komplexiert vorliegen . Die freie Fettsäuremischung bestand aus Palmitinsäure, Palmitoleinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure. Kubotas Medium ist im Handel erhältlich bei PhoenixSongs Biologicals (Branford, CT).

Zu den verwendeten Hyaluronanen (HAs) gehörten die löslichen, langkettigen Formen von HA (Sigma-Katalog-Nr. 52747) und wurden zur Stabilisierung von Organoidkulturen und zur Kryokonservierung von Zellsuspensionen verwendet^71,72. Die zur Herstellung der Hydrogele verwendeten Thiol-modifizierten HAs wurden von Glycosan Biosciences, einer ehemaligen Tochtergesellschaft von Lineage Cell Therapeutics (Alameda, CA), bezogen und werden jetzt in nichtklinischer Form von Advanced Biomatrix (Carlsbad, CA) angeboten in klinischer Form von Sentrex Animal Care (Salt Lake City, UT) (G. Prestwich, persönliche Mitteilungen). Die Komponenten für diese Thiol-modifizierten HAs wurden durch ein proprietäres bakterielles Fermentationsverfahren hergestellt Bacillus subtilis als Host in einem ISO 9001:2000-Prozess (www.biopolymer.novozymes.com/). Die Komponenten wurden von Novozymes unter dem Handelsnamen HyaCare® hergestellt und sind zu 100 % frei von tierischen Materialien und organischen Lösungsmittelrückständen. Bei der Herstellung werden keine tierischen Inhaltsstoffe verwendet; Es gibt sehr niedrige Proteingehalte und keine Endotoxine. Die Produktion folgt den Standards des Europäischen Arzneibuchs. Die HA-Hydrogele wurden unter Verwendung von Glycosil (HyStem® HAs, ESI BIO-CG313), den Thiol-modifizierten HAs, die in Gegenwart von Sauerstoff zur Bildung von Disulfidbrücken angeregt werden können, oder durch Bildung von Thioetherbindungen unter Verwendung von Polyethylenglykoldiacrylat (PEGDA) hergestellt ). Glycosil® wird als 1 %ige Lösung von thiolierter HA in 1 % phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) unter Verwendung von entgastem Wasser oder, in unserem Fall, in serumfreiem Kubota-Medium rekonstituiert. Nach der Rekonstitution bleibt es mehrere Stunden lang flüssig, kann jedoch unter Einwirkung von Sauerstoff eine gewisse Gelierung erfahren. Eine präzisere Gelierung erfolgt ohne Temperatur- oder pH-Änderungen, wenn Glycosil mit einem Vernetzer wie PEGDA behandelt wird, wodurch die Gelierung innerhalb weniger Minuten erfolgt^73,74,75,76.

Der Grad der Vernetzung trägt in erster Linie zum Grad der Steifheit (Viskoelastizität) oder Steifheit bei und kann durch Anpassen des Verhältnisses der thiolmodifizierten Hyaluronane zu PEGDA gesteuert werden⁷⁶. In früheren Studien wurden hepatische Stammzellpopulationen in HA-Hydrogeln unterschiedlicher Steifigkeit getestet und es wurde festgestellt, dass sie sowohl antigenisch als auch funktionell (z. B. in Bezug auf die Migrationsfähigkeit und die Expression stammzellassoziierter Gene) als Stammzellen verbleiben wie Pluripotenzgene und Matrixmetalloproteinasen), nur wenn der Grad der Steifigkeit weniger als ~100 Pa betrug⁷⁶. Wir haben diese Erkenntnis genutzt, um Transplantate mit einer weichen Schicht (~100 Pa oder weniger) zu entwerfen, in die Organoide von BTSCs eingebettet werden können, und mit steiferen Schichten (~700 Pa) aus Hyaluronan-Hydrogelen im Träger, um eine Barriere gegen Migration in andere Richtungen zu bilden als das Zielgewebe sowie solche mit mittlerer Steifigkeit (~200–300 Pa), um Adhäsionen zu minimieren.

Die rheologischen Eigenschaften von Hyaluronan-Hydrogelen im Makromaßstab wurden mit einem spannungsgesteuerten Kegel-Platte-Rheometer (TA Instruments, AR-G2, 40 mm Kegeldurchmesser, 1° Winkel) bestimmt. Gele polymerisierten aktiv auf dem Rheometer, während sie mit einer Frequenz von 1 rad/s und einer Spannungsamplitude von 0.6 Pa oszillierten, wobei der Modul kontinuierlich überwacht wurde, um sicherzustellen, dass die Vernetzungsreaktionen ausreichend abgeschlossen waren. Nach dem Äquilibrieren wurden die Hydrogele einem oszillierenden Frequenzdurchlauf unterzogen (Spannungsamplitude: 0.6 Pa, Frequenzbereich: 0.01–100 Hz).

Die Zellpräparation erfolgte aus extrahepatischem Gallenbaumgewebe (Gallenblase, Gallengang, Lebergänge), das von Schweinen [oder aus menschlichem Gewebe] stammte. Bei den Geweben, die zur Erzeugung von Organoiden normaler Zellen verwendet wurden, wurde das Gewebe mit einem sterilisierten Edelstahlhammer geschlagen, um die Parenchymzellen zu entfernen und dabei die Verbindung der intrahepatischen und extrahepatischen Gallengänge sorgfältig aufrechtzuerhalten. Der Gallenbaum wurde dann mit dem „Zellwasch“-Puffer gewaschen, der aus einem sterilen, serumfreien Basalmedium, ergänzt mit Antibiotika, 0.1 % Serumalbumin und 1 nM Selen (10) bestand^-9 M). Anschließend wurde es mit gekreuzten Skalpellen mechanisch dissoziiert und die Aggregate enzymatisch in einer Zellsuspension in RPMI-1640 dispergiert, ergänzt mit 0.1 % Rinderserumalbumin (BSA) [oder für menschliches Gewebe, menschliches Serumalbumin, HAS], 1 nM Selen, 300 U/ml Typ-IV-Kollagenase, 0.3 mg/ml Desoxyribonuklease (DNAse) und Antibiotika. Der Aufschluss erfolgte bei 32 °C unter häufigem Rühren für 30–60 Minuten. Die meisten Gewebe erforderten zwei Verdauungsrunden, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1100 U/min und 4 °C. Zellpellets wurden kombiniert und in der Zellwäsche resuspendiert. Die Zellsuspension wurde bei 30x zentrifugiertg für 5 Minuten bei 4 °C, um rote Blutkörperchen zu entfernen. Die Zellpellets wurden erneut in Zellwaschlösung suspendiert und durch ein 40-µm-Nylon-Zellsieb (Becton Dickenson Falcon Nr. 352340) mit frischer Zellwaschlösung filtriert. Die Zellzahlen wurden bestimmt und die Lebensfähigkeit wurde mit Trypanblau beurteilt. Routinemäßig wurde eine Zelllebensfähigkeit von über 90–95 % beobachtet.

Die Bildung von Organoiden erfolgte aus Zellsuspensionen, die in serumfreiem Kubota-Medium in Multiwell-Zellkulturplatten mit flachem Boden (Corning Nr. 353043) gegeben und etwa eine Stunde lang bei 37 °C inkubiert wurden, um die Anlagerung reifer mesenchymaler Zellen (z. B. reifes Stroma) zu erleichtern , reife Sternzellen). Reife mesenchymale Zellen hefteten sich innerhalb von etwa 15 Minuten an die Schalen, obwohl das Medium serumfrei war. Die unreifen Zellen blieben in Suspension und wurden in eine andere Schale überführt und erneut bis zu einer Stunde inkubiert. Dies wurde mehrmals wiederholt, um sicherzustellen, dass ein erheblicher Teil der reifen mesenchymalen Zellen abgereichert wurde. Nach der Erschöpfung der reifen mesenchymalen Zellen wurden die verbleibenden schwimmenden Zellen mit ~2 × 10 ausgesät⁵ Zellen pro Vertiefung in serumfreiem Kubota-Medium in Cornings Ultra-Low-Attachment-Schalen (Corning Nr. 3471) und wurden über Nacht bei 37 °C in einem CO inkubiert₂ Inkubator. Über Nacht bildeten sich Organoide, die aus Gallenbaumstammzellen (BTSCs) und mesenchymalen Zellen im frühen Abstammungsstadium (ELMSCs) bestehen. Durch die Expression spezifischer Oberflächenantigene wurde festgestellt, dass es sich bei den ELMSCs um Angioblasten (CD117) handelt⁺, CD31^-, VEGFr⁺) und Vorläufer von Endothelien (CD31⁺, VEGFr⁺) und zu Sternzellen (ICAM-1⁺, CD146⁺). Es wurden ausführlichere Charakterisierungen dieser ELSMCs durchgeführt und die Ergebnisse wurden bereits veröffentlicht^77,78. Die Organoidkulturen überlebten wochenlang in Kubotas Medium, insbesondere wenn das Medium mit löslichen Formen von Hyaluronanen (Sigma) (0.1 %) ergänzt wurde.

Die Zellen könnten auch wie unten beschrieben kryokonserviert werden. Aus jedem Gramm Schweinegallenbaumgewebe erhielten wir ~1.5 × 10⁷ Zellen. Wir haben ~3–6 × 10 verwendet⁵ Zellen pro Vertiefung einer 6-Well-Ultra-Low-Attachment-Platte und Inkubation im serumfreien Kubota-Medium. Die Zellen produzierten im Durchschnitt 6000–20,000 kleine Organoide (~50–100 Zellen/Organoid/Vertiefung). Für die Transplantate haben wir mindestens 100,000 Organoide (>10) verwendet⁷ Zellen). Abhängig von der Größe des Trägers konnten wir die Anzahl der Organoide in den Transplantaten auf bis zu >10 erhöhen⁸ Organoide (d. h. ~10⁹ Zellen insgesamt) oder mehr, eingebettet in ~1 ml des weichen Hyaluronan-Hydrogels auf einer 3 cm × 4.5 cm großen Unterlage.

Die Kryokonservierung von Stamm-/Vorläuferzellen wurde am erfolgreichsten durch Kryokonservierung von isolierten Zellen oder kleinen Zellaggregaten durchgeführt, die den Panning-Verfahren unterzogen wurden, um die Anzahl reifer mesenchymaler Zellen zu minimieren. Man kann die Mischung aus Stamm-/Vorläuferzellen und mesenchymalen Zellen im frühen Abstammungsstadium in Cryostor10 kryokonservieren, einem isotonischen Kryokonservierungspuffer, der Frostschutzfaktoren, Dextran und DMSO enthält (Bioliife, Seattle, WA). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch die Ergänzung mit 0.1 % HAs (Sigma #52747) weiter verbessert.^71,72. Die höchste Lebensfähigkeit der Organoide wurde erreicht, wenn sie aus frisch aufgetauten, kryokonservierten Zellsuspensionen hergestellt wurden; Bei kryokonservierten, vollständig ausgebildeten Organoiden wurden geringere Lebensfähigkeiten beobachtet. Die Kryokonservierung erfolgte mit CryoMed™-Gefriergeräten mit kontrollierter Geschwindigkeit. Die Lebensfähigkeit beim Auftauen betrug mehr als 90 % für diejenigen, die als Zellsuspension kryokonserviert und dann nach dem Auftauen zur Bildung von Organoiden verwendet wurden^71,72.

Patch-Grafts sind neuartige Methoden, die sich schnell zur Transplantation großer Mengen (z. B. >10) etabliert haben⁸th) von Organoiden zu festen Organen zu entwickeln und die Organoide innerhalb einer Woche vollständig in die Organe zu integrieren und innerhalb einer weiteren Woche zu adulten Zellen heranzureifen. Weitere Einzelheiten zur Logik, Strategien und Methoden der Patch-Transplantation von Organoiden in feste Organe finden Sie in unseren früheren Veröffentlichungen^54,55. Die Transplantate wurden unter Verwendung einer Unterlage, Contour Seri-silk (Sofregen, Medford, MA), geformt, auf der die Stamm-/Vorläuferorganoide platziert wurden, eingebettet in weiche Hyaluronan-Hydrogele (~50–100 Pa). Diese wurden einfach im Voraus zubereitet und über Nacht in einer Kulturschale in einem Inkubator aufbewahrt. Der mangelnde Erfolg bei Versuchen, Organoide in weichen Hydrogelen zu kryokonservieren, führte dazu, dass die Einbettung der Organoide in das weiche Hydrogel unmittelbar vor der Operation zur Befestigung der Transplantate erfolgen musste.

Aktualisierung: Wir haben erfahren, dass Contour Seri-Silk vom Hersteller nicht mehr erhältlich ist. Matrixmaterialien auf Amnionbasis, beispielsweise von Vivex Biologics (Miami, FL), sollten einen geeigneten Ersatz darstellen und sind ein von der FDA zugelassenes Implantatmaterial für klinische und nichtklinische Zwecke. Diese sollten eine angemessene mechanische Unterstützung für die Transplantate bieten und dürften hinsichtlich der Auswirkungen auf Spenderorganoide einigermaßen neutral sein; Dies ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Organoide ihre Stammzellmerkmale behalten, die es ihnen ermöglichen, Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) zu exprimieren, die für die Transplantation und Migration erforderlich sind⁵⁴. Klinische Anwendungen solcher aus Amnion gewonnenen Matrizen wurden von anderen in einer kürzlich erschienenen Übersichtsarbeit diskutiert⁷⁹. Es wird davon ausgegangen, dass das steifere Hyaluronan-Hydrogel (~700 Pa) angesichts der komplexen Matrixchemie im Amnion, das als Barriere dienen sollte, nicht erforderlich sein wird. Es wird jedoch die Hypothese aufgestellt, dass eine Amnion-Matrix-Barriere nach der Anbindung an die Zielstelle möglicherweise noch eine beidseitige Beschichtung mit Hyaluronanen und eine mit serumfreiem Kubota-Medium zubereitete Hyaluronan-Lösung mit mittlerer Steifigkeit (~200–300 Pa) erfordern könnte ). Die Beschichtung auf der serösen Seite zum Zeitpunkt der Operation sollte Adhäsionen an benachbarten Geweben minimieren.

Für Autopsieverfahren wurden alle Tiere zum festgelegten Zeitpunkt durch Sedierung mit Ketamin/Xylazin und Isofluoran-Anästhesie menschlich eingeschläfert, gefolgt von einer intravenösen Injektion einer tödlichen Dosis Natriumpentobarbital. Nach Bestätigung des Todes wurde der Kadaver sorgfältig seziert, die Zielorgane entnommen und für den Transport ins Labor in gekühltes Kubota-Medium gelegt. Zusätzlich zur Leber wurden Lunge, Herz, Niere und Milz entnommen und in 10 % neutralem Formalin fixiert.

Die Histologie wurde an Teilen des frisch präparierten Gewebes der Schweine durchgeführt oder die Transplantate auf Leber oder Bauchspeicheldrüse wurden mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert und dann in Paraffin eingebettet. Für routinemäßige histologische Analysen wurden XNUMX-Mikrometer-Schnitte geschnitten und mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Die von neugeborenen Schweinen gewonnenen Gewebe wurden auch als Proben (Leber, Bauchspeicheldrüse, Gallengang und Zwölffingerdarm) in großen Paraffinblöcken vorbereitet, um Analysen der Verbindungen im gesamten Gallengang und Pankreasgangsystem zu erleichtern.

Die Immunhistochemie (IHC) wurde zur Analyse verschiedener Marker und Merkmale eingesetzt. Zur Immunfluoreszenzfärbung wurden 5 µm große Gefrierschnitte oder kultivierte Zellen 4 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 20 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert, mit PBS gespült, 10 Stunden lang mit 2 % Ziegenserum in PBS blockiert und gespült. Fixierte Zellen wurden mit Primärantikörpern 4 Stunden lang bei 14 °C inkubiert, gewaschen, 1 Stunde lang mit markierten Isotyp-spezifischen Sekundärantikörpern inkubiert, gewaschen und zur Visualisierung mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gegengefärbt Zellkerne untersucht und mit dem inversen Mikroskop Leica DMIRB (Leica, Houston, TX) oder einem Zeiss ApoTome Axiovert 200 M (Carl Zeiss Inc, Thornwood, NY) betrachtet.

Für die IHC wurden die Gewebe über Nacht in 4 % PFA fixiert und in 70 % Ethanol gelagert. Sie wurden in Paraffin eingebettet und in 5 µm große Abschnitte geschnitten. Nach der Entparaffinierung wurde die Antigengewinnung mit Natriumcitratpuffer (pH 6.0) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Puffer (pH 8.0) in einem Dampfgarer für 20 Minuten durchgeführt. Endogene Peroxidasen wurden durch 15-minütige Inkubation in 3 % H blockiert₂O₂. Die Schnitte wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit ImmPRESS-Peroxidase-Färbekits und 3,3'-Diaminobenzidin-Substraten (Vector Laboratories) inkubiert. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die verwendeten Antikörper sind in der Ergänzungstabelle aufgeführt 1.

Für verschiedene Analysen war die Reinigung von Zellpopulationen für genetische Studien wichtig. Die Reinheit der zu isolierenden Subpopulationen wurde durch eine Kombination von Strategien zur Isolierung der Zellen bestimmt. Die adulten Hepatozyten wurden durch Standard-Kollagenase-Verdauung und Percoll-Fraktionierung frisch aus neonatalen Schweinelebern im Vergleich zu neonatalen, pädiatrischen und erwachsenen menschlichen Lebern isoliert⁸⁰. Die isolierten adulten Hepatozytenfraktionen (solche mit durchschnittlichen Durchmessern über 17 µm) wurden in RPMI1640, ergänzt mit 2 % Serum, gespült, um die bei der Isolierung der Zellen verwendeten Enzyme zu inaktivieren; dann mit mehreren Spülgängen mit serumfreiem RPMI 1640-Medium behandelt; und schließlich mit flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Zellen wurden nicht kultiviert.

Die Subpopulationen von Stamm-/Vorläuferzellen, sowohl von Menschen als auch von Schweinen, wurden aus frisch isolierten Zellen aus dem fetalen oder neonatalen Gallenbaum (Gallenbaum-Stammzellen), aus fetalen oder neonatalen Lebern (hepatische Stammzellen und Hepatoblasten) oder aus fetalen oder neonatalen Zellen hergestellt Bauchspeicheldrüse (Pankreasstammzellen und duktale Vorläuferzellen); durch eine Kombination von Immunselektion auf Oberflächenantigene gereinigt, was die Isolierung separater zellulärer Subpopulationen ermöglicht^39,41,50,54. Ergänzungstabelle 5 fasst die Marker der Subpopulationen zusammen, die insbesondere in früheren Studien ausführlich charakterisiert wurden^{31,32,33,38,39,40,41,42,43,49,50}.

Die immunselektierten Zellen wurden in serumfreiem Kubota-Medium suspendiert⁸¹, für endodermale Stammzellen konzipiert und 6–12 Stunden lang auf Kulturschalen mit geringer Anhaftung ausgesät, um die Bildung von Organoiden zu ermöglichen. Die Organoide, die sich in diesen 6–12 Stunden bildeten, umfassten die endodermalen Stammzellen, die mit mesenchymalen Zellen im frühen Abstammungsstadium zusammenarbeiteten: Angioblasten und Vorläufer von Endothel- und Sternzellen (Hinweis: Die reifen mesenchymalen Zellen wurden durch den Immunselektionsprozess minimiert, was durch die Erschöpfung angezeigt wird Zellen für Oberflächenantigene für die reifen hämatopoetischen und mesenchymalen Zellen).

Die RNA-Sequenzierung und Genexpressionsanalyse umfasste mit dem Qiagen RNeasy Kit gereinigte RNA aus erwachsener Leber, Bauchspeicheldrüse, Gallenblase und Gallenbaumgewebe von Schweinen (oder Menschen) sowie aus isolierten Zellsuspensionen von Hepatozyten (AHeps), hepatischen Stammzellen (HpSCs), Gallenbaumstammzellen (BTSCs), jeweils von drei verschiedenen Spendern für menschliche Zellen und fünf verschiedenen Spendern für Schweinezellen (Ergänzungstabellen). 6 machen 7). Die RNA-seq-Datenerfassung und Qualitätskontrollanalysen wurden in unserer vorherigen Studie speziell dargestellt⁵². Die LIMMA-Pipeline (Version 3.50.1) wurde verwendet, um differentiell exprimierte Gene (DEGs) zu identifizieren. Genexpressionsprofile wurden mithilfe der Korrelationsanalysen von Pearson und Spearman verglichen. Hauptkomponentenanalyse (PCA) und hierarchisches Clustering wurden in R (R Version 4.1.0) durchgeführt.

Quantitative Reverse Transkription und Polymerasekettenreaktion wurden unter Verwendung von Gesamt-RNA aus Zellen durchgeführt. Die Gesamt-RNA wurde mit Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) aus den Zellen extrahiert. Als Vorlage für die PCR-Amplifikation wurde Erststrang-cDNA verwendet, die mit dem Prime-Script-1st-Strang-cDNA-Synthesekit (Takara, Otsu, Japan) synthetisiert wurde. Quantitative Analysen der mRNA-Spiegel wurden unter Verwendung von Faststart Universal Probe Master (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) mit dem ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt. Die Primer wurden mit dem Universal Probe Library Assay Design Center (Roche Applied Science) entwickelt. Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle aufgeführt 4a. Die Primer wurden 50 Minuten lang bei 2 °C und 95 Minuten lang bei 10 °C getempert, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 °C (15 s) und 60 °C (1 Minute). Die Expression von Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) wurde im Allgemeinen als Standard verwendet.

statistische Analyse

Statistisch signifikante Unterschiede zwischen Stichproben werden mithilfe der zweiseitigen Methode von Student berechnet t-Test und Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD dargestellt. P Werte von <0.05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Berichtzusammenfassung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie im Nature Portfolio-Berichtszusammenfassung mit diesem Artikel verlinkt.

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• Quelle: https://www.nature.com/articles/s41536-023-00303-5