Estudios in vitro

BPA

Stella Chemifa Corporation (Osaka, Japón) suministró amablemente BPA (isómero L) y se convirtió en complejo de fructosa antes de la incubación.³⁵. Por lo tanto, el BPA utilizado en el presente estudio se utilizó como un complejo de fructosa.

Líneas celulares y cultivo celular.

En este estudio, utilizamos dos líneas GSC humanas (HGG13, HGG30) y una línea GSC de ratón (TS). (Higo. 1C.A). Según el protocolo aprobado por la junta de revisión institucional de acuerdo con las pautas del Instituto Nacional de Salud (NIH), las dos líneas GSC humanas (HGG13 y HGG30) se establecieron a partir de muestras quirúrgicas de gliomas malignos después de obtener el consentimiento informado por escrito de los donantes, como se describió anteriormente.^{36,37,38,39,40}. En el presente estudio, estas líneas de GSC humanas se usaron después de obtener la aprobación del Comité de Ética de Investigación de la Facultad de Medicina de Osaka (Aprobación No.: E14-2023).

Estas GSC humanas se clasificaron como GSC de tipo mesenquimatoso en función de sus perfiles de expresión génica.³⁷. Las células HGG13 y HGG30 se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 (Thermo Fisher Scientific, Indianápolis, IN, EE. UU.) complementado con 20 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF; PeproTech, Rocky Hill, NJ, EE. /mL de sulfato de heparán, GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), 20 U/mL de penicilina y 27 ng/mL de estreptomicina (Thermo Fisher Scientific) a 200 °C en un 100 % de CO₂ ambiente^37,41.

Las células TS son GSC murinas establecidas mediante la sobreexpresión de H-RAS V12 en células madre/progenitoras neurales normales aisladas de la zona subventricular de ratones B6 adultos que albergan una deleción homocigota del locus INK4a/Arf⁴². Las células TS se cultivaron en DMEM/F12 (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) suplementadas con 20 ng/mL de EGF (PeproTech), 20 ng/mL de bFGF (PeproTech), suplemento B27 sin vitamina A (Thermo Fisher Scientific), 200 ng/mL de sulfato de heparán, 100 U/mL de penicilina y 100 ng/mL de estreptomicina (Thermo Fisher Scientific) a 37 °C en un 5% de CO₂ ambiente⁴².

Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real para la expresión génica

El ARN total se extrajo de las células usando el kit de extracción de ARN (miRNeasy Mini #217,004; QIAGEN, Tokio, Japón) y se sometió a la síntesis de ADNc usando el Transcriptor First-Strand cDNA Synthesis Kit (SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit #11754-050; Thermo Fisher Scientific). La reacción se llevó a cabo en LightCycler (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza) según el protocolo de ensayo TaqMan. La reacción consistió en un paso de desnaturalización (95 °C por 15 min), y el proceso de amplificación y cuantificación se repitió 45 veces (95 °C por 15 s y 60 °C por 40 s). Los datos se analizaron utilizando el software LightCycler 3. Los niveles de ARNm de SLC3A2, LAT1 (SLC7A5), ATB^{0, +} (SLC6A14), Nrf2, HO-1 (HMOX1), o SOD2 se midieron. Los detalles del cebador se proporcionan en la tabla complementaria S1. Los niveles relativos de ARNm se calcularon como la relación entre el gen objetivo y GAPDH y β-actina con referencia a los niveles de ARNm de GAPDH y β-actina de cada muestra.

Captación in vitro de BPA en GSC

Las células HGG13, HGG30 y TS se incubaron con medio que contenía ácido 5-aminolevulínico (ALA) (Cosmo Bio, Tokio, Japón) (0, 33, 100, 300 y 900 μΜ) durante 24 h. Después de la incubación, las células se centrifugaron y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Luego, las células se expusieron a medio que contenía BPA 1 mM durante 6 h, después de lo cual las células se centrifugaron y se lavaron dos veces con PBS. Luego, las células se digirieron durante 24 h con una solución de ácido nítrico 1 N (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón). La concentración intracelular de ¹⁰B se midió utilizando espectroscopía de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente (ICP-AES; espectrómetro de emisión iCAP6000, Hitachi High-Technologies, Tokio, Japón). Todos los experimentos anteriores se realizaron en condiciones de oscuridad para evitar el efecto fotodinámico en las células tumorales expuestas a ALA.

Experimentos con animales

Ética animal

Todos los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Ético sobre el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Facultad de Medicina de Osaka (Aprobación No. 30036) y el Instituto de Reactores de Investigación de la Universidad de Kyoto (KURNS; Kumatori, Osaka, Japón) (Aprobación No. P10-8), respectivamente. El alojamiento de animales y los siguientes métodos y procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las normas y directrices de nuestras instituciones (OMC y KURNS), las cuales cumplen con las Directrices ARRIVE 2.0. (PLoS Bio 8(6), e1000412,2010).

Modelo de glioma de ratón utilizando una línea GSC (HGG13)

Para el trasplante de células HGG19 (Japan SLC, Hamamatsu, Japón) se utilizaron ratones desnudos BALB/c macho de siete semanas de edad [23–13 g de peso corporal (bw)]. Todos los animales fueron criados en salas de animales libres de patógenos específicos (SPF) y alimentados con una dieta estándar. Los ratones se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de medetomidina (0.3 mg/kg), midazolam (4 mg/kg) y butorfanol (5 mg/kg) y se colocaron en un marco estereotáctico (modelo 51,625; David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EE. UU.). Se realizó una incisión en la línea media del cuero cabelludo, después de lo cual se perforó un pequeño orificio de trepanación de 2 mm lateral derecho al bregma con un taladro eléctrico. Se insertó una microjeringa Hamilton de 25 μL con una aguja de calibre 22 (modelo 1700RN, Hamilton Bonaduz, Bonaduz, Suiza) a 4 mm de profundidad del cráneo y se retiró a 1 mm del objetivo en el cerebro (3 mm de la superficie del cráneo). Dado que las células HGG13 forman esferoides, las células se dispersaron pipeteando y se confirmó que eran unicelulares usando un microscopio. Diez mil células HGG13 suspendidas en 2 μL de DMEM sin suero se inyectaron a una velocidad de 1 μL/min utilizando una bomba de infusión automática. La aguja se colocó durante 2 min después de la infusión y se retiró lentamente. El agujero de trepanación del cráneo se selló con cera ósea y el cuero cabelludo se suturó con un clip esterilizado.

Estudios de biodistribución de boro usando el modelo de glioma implantado con HGG13

La biodistribución de BPA se evaluó 14 días después de la implantación de células HGG13 en el cerebro del ratón. Se administró oralmente ALA o PBS (80 mg/kg pc) a ratones 24 h antes de la administración de BPA. BPA (250 mg/kg pc, equivalente a 12 mg ¹⁰B/kg bw) se administró por vía intraperitoneal. Después de 2.5 horas de administración de BPA, los ratones fueron sacrificados y se recogieron el tumor y la sangre para medir el tejido. ¹⁰Concentración de B usando ICP-AES como describimos anteriormente⁴³.

Estudios BNCT in vivo usando el modelo de glioma implantado con HGG13

El estudio BNCT in vivo se realizó utilizando ratones modelo de glioma implantados con HGG13 en el reactor de la Universidad de Kyoto (KUR) siete días después de la implantación de células tumorales. Cuarenta y cuatro ratones con glioma se dividieron aleatoriamente en seis grupos: grupo 1, control sin tratar (n = 5); grupo 2, control de solo ALA (n = 5); grupo 3, control solo de irradiación de neutrones (n = 7); grupo 4, irradiación de neutrones después de ALA (n = 6); grupo 5, irradiación de neutrones después de BPA (n = 10); y grupo 6, irradiación de neutrones tras la combinación de ALA y BPA (n = 9).

Se administró ALA por vía oral a 80 mg/kg de peso corporal a los animales de los grupos 2, 4 y 6, 24 h antes de la administración de BPA. BPA (250 mg/kg pc, equivalente a 12 mg/kg ¹⁰B/kg bw) se administró por vía intraperitoneal a los grupos 5 y 6, y se administró PBS a los animales en otros grupos. Los ratones de los grupos 3 a 6 se irradiaron con una potencia de reactor de 1 MW en la instalación de irradiación de neutrones de agua pesada (HWNIF) durante 50 min, 2.5 h después de la administración de BPA. La irradiación simulada se realizó en ratones en los grupos 1 (sin BPA ni ALA) y 2 (sin BPA, solo precarga de ALA). Después de la cirugía de implantación, se controló diariamente el peso corporal y la función neurológica de los ratones. Un día antes de que la muerte fuera inminente (definida por una pérdida de peso significativa y falta de actividad o déficits neurológicos severos como parálisis o ataxia y la aparición de convulsiones), los ratones fueron sacrificados de acuerdo con las pautas ARRIVE 2.0.

Los efectos terapéuticos de BNCT se evaluaron midiendo el tiempo de supervivencia de ratones portadores de glioma. Se calculó la mediana del tiempo de supervivencia y se trazaron las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para todos los grupos. Se realizó una prueba de rango logarítmico general para probar la igualdad de las curvas de supervivencia entre los grupos.

Estimación de las dosis físicas y equivalentes administradas al modelo de tumor cerebral en ratones portadores de glioma GB13 en los experimentos BNCT

La estimación de la dosis física y la dosis equivalente administrada a los ratones se realizó como se describió anteriormente.^44,45. La dosis BNCT es la suma de la dosis física atribuida al ¹⁰B (n, a) ⁷li y ¹⁴norte (norte, p) ¹⁴C reacciones de captura, la ¹H (norte, norte) ¹Reacción de dispersión de H y rayos gamma, que se puede describir mediante la siguiente ecuación:

donde D_B (dosis de boro) = 7.43 × 10^-14 (Gycm²/μg ¹⁰B/g) × concentración de boro (μg ¹⁰B/g) × fluencia de neutrones térmicos (1/cm²), o D_N (dosis de nitrógeno) = 6.78 × 10^-14 (Gycm²/% en peso × concentración de nitrógeno (% en peso) × fluencia de neutrones térmicos (1/cm2). Los valores numéricos anteriores fueron tomados de un estudio previo.⁴⁶. La fluencia de neutrones térmicos se midió mediante la radiactividad de una hoja de oro (0.05 mm de espesor, 3 mm de diámetro) que se fijó en la superficie de las cabezas de los ratones irradiados. D_H es la dosis física debida a la dispersión elástica entre los neutrones epitermales o rápidos y el núcleo de hidrógeno⁴⁷. D_γ es la dosis medida de rayos gamma mezclados en el haz de neutrones⁴⁸. Para evaluar el efecto terapéutico de BNCT, cada valor de dosis de radiación se multiplicó por la eficacia biológica relativa (RBE) para cada tejido para obtener la dosis equivalente, de la siguiente manera:

En BNCT, la eficacia biológica relativa (RBE) se expresa como la eficacia biológica compuesta (CBE), que corresponde a las propiedades biológicas de los compuestos de boro. Su valor para BPA es de 3.8 para glioma y de 0.9 para cerebro⁴⁹. RBE para nitrógeno (RBEN) e hidrógeno (RBEH) es 3.0⁵⁰.

Expresión de SLC3A2, LAT1 (SLC7A5) y ATB^{0, +} en tumores derivados de HGG13

Examinamos el efecto de ALA en la expresión de SLC3A2, SLC7A5y ATB^{0, +} en tumores derivados del modelo de ratones con glioma implantado HGG13. Catorce días después de la implantación de células HGG13, a los ratones se les administró ALA (80 mg/kg pc) o PBS (control). Veinticuatro horas más tarde, se sacrificó a los ratones y se extirparon los tumores de los cerebros para extraer el ARN. El análisis de la expresión génica se realizó mediante RT-PCR.

análisis estadístico

Los datos in vitro se generaron a partir de al menos tres experimentos independientes. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando JMP Pro ver. 13 para Mac (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE. UU.). Los datos se presentan como media ± SE. La comparación entre dos grupos se realizó mediante la prueba t de Student. A p-valor inferior a 0.05 se consideró estadísticamente significativo. La supervivencia de los ratones implantados con GSC se calculó para cada grupo utilizando el método de Kaplan-Meier, y se utilizó la prueba de rango logarítmico para determinar las diferencias entre las curvas de supervivencia. Se utilizó un modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox para analizar los datos de supervivencia, con la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples.

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41598-023-37296-6