Ratones

Se alojaron en grupo y se mantuvieron ratones C2BL4/J, Lgr18-ki-eGFP-creER y Olfm26-ki-eGFP-creER, machos y hembras, jóvenes (de 57 a 6 meses de edad) y mayores (de 5 a 4 meses de edad), de tipo salvaje, en una instalación para animales libre de patógenos oportunistas específicos (SOPF) en el Instituto Fritz Lipmann con 12 h de ciclo de luz/oscuridad y alimentado con una comida estándar para ratones a una temperatura de 20 ± 2 °C, rlH 55 % ± 15. Los experimentos se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados. por el gobierno estatal de Turingia Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz (TLV) (número de licencia: TG/J-0002858/A; TG/J-0003616/A; TG/J-0003681/A; FLI-17-109; FLI- 18-005, FLI-20-005).

Aislamiento de criptas del intestino delgado

Las criptas del intestino delgado se aislaron siguiendo el protocolo establecido.⁶⁰ con algunas modificaciones. Brevemente, se diseccionó el intestino delgado del ratón y se lavó en PBS frío. Los trozos intestinales libres de vellosidades (2 cm) se lavaron con PBS frío y se transfirieron a EDTA/PBS 5 mM, seguido de dos incubaciones de 30 minutos a 4 °C en un rotador. El tejido se transfirió a PBS fresco y frío y se agitó manualmente durante 30 segundos. La solución de la cripta se filtró utilizando un colador celular de 70 µm y se centrifugó a 450 × g durante 5 min a 4°C. Las criptas aisladas se utilizaron inmediatamente o se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para experimentos adicionales. Para el aislamiento de ARN, las criptas se resuspendieron inmediatamente en reactivo de lisis QIAzol (Qiagen) y se almacenaron a -80 °C.

Aislamiento y clasificación de células madre intestinales.

Para aislar las ISC Lgr5-eGFP y Olfm4-eGFP, las criptas recién aisladas se disociaron con la mezcla de 18 ml de TrypLE Express, 2 ml de tampón DNasa I 10 × (Tris-HCl 100 mM, pH 7.5, MgCl 25 mM).₂, CaCl 5 mM₂) y 1 ml de DNasa I (10 mg/ml) durante 30 min a 37 °C con agitación breve cada 10 min. Luego, la suspensión unicelular se pasó a través de un filtro celular de 20 µm y se centrifugó a 800 × g durante 5 min a 4°C. El sedimento celular se resuspendió en 3 ml de medio de tinción FACS (FSM) que contenía PBS suplementado con suero bovino fetal al 2 %, EDTA 2.5 mM, Y10 27632 µM y DAPI (1:1000). La suspensión de células individuales se aplicó a FACS LSRII (BD Biosciences) y Lgr5-eGFP^hi o los ISC Olfm4-eGFP se clasificaron para el análisis posterior como se describió anteriormente⁶¹.

cultivo organoide

Los organoides del intestino delgado se cultivaron según el protocolo establecido.⁶². Brevemente, las criptas aisladas se mezclaron con Matrigel y se sembraron en placas de 24 pocillos. Después de la polimerización de Matrigel, medio de cultivo de criptas (DMEM avanzado/F12, 1× Glutamax, HEPES 10 mM, suplemento de N2 (1:100), suplemento de B27 (1:50), penicilina/estreptomicina 0.5 U/ml, 50 ng/ml Se añadió factor de crecimiento epitelial recombinante de ratón, 100 ng/ml de Noggin recombinante de ratón y 500 ng/ml de R-espondina1 recombinante humana. Para el tratamiento con IFNγ, se pasaron organoides cultivados durante dos semanas y, el día 3, se les añadió IFNγ (2 ng/ml). Después de 24 h, se recogieron los organoides, se lavaron con PBS y se procesaron para obtener secuencias de ARN unicelular. Para bloquear la señalización de Stat1, los organoides se trataron con IFNγ 2 ng/ml con o sin ruxolitinib (10 µM) durante 3 días y luego se recogieron para análisis FACS o qRT-PCR. Se usó IFNγ a una concentración de 0.2 ng/ml para el experimento de resiembra y para el experimento de Baricitinib (2 µM).

Tinción de anexina V

Después de la preparación de células individuales a partir de organoides como se describe anteriormente, las células se resuspendieron en 200 µl de tampón de unión 1X y 1 µl de APC Anexina V del kit de detección de apoptosis de BD Bioscience después de una incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de lavar con tampón de unión 1X, las células se resuspendieron en tampón de unión 1X (100 µl) y se analizaron usando FACSAriaII (BD Biosciences) y los datos se analizaron usando el software FlowJo.

Análisis de proliferación de BrdU.

Se añadió BrdU (10 µM) a los organoides 6 h antes de la recolección. Después de la preparación de células individuales a partir de organoides como se describe anteriormente, se usó el kit de flujo BrdU de BD Bioscience para cuantificar el porcentaje de células en proliferación en el cultivo de organoides. Las células se analizaron utilizando FACSAriaII y se utilizó el software FlowJo para el análisis.

Experimento de cocultura

Se cocultivaron organoides tratados con IFNγ (0.2 ng/ml durante 2 días) o no tratados con Cd45 recién aislado y clasificado.⁺ células de ratones jóvenes durante 3 días. Aproximadamente 2 × 10⁵ CD45⁺ Las células se mezclaron con 100 organoides y se resuspendieron en Matrigel (concentración final del 30%). Luego, las células inmunes se aislaron del cultivo y, después de teñirlas, se analizaron utilizando FACSAriaII. Se utilizó el software FlowJo para calcular el porcentaje de diferentes poblaciones de células inmunes.

Bloqueo in vivo de IFNγ

A ratones viejos se les inyectó por vía intraperitoneal anti-IFNγ de ratón (25 mg/kg) o anticuerpo anti-IgG1 durante dos semanas (3 inyecciones por semana). Los ratones fueron sacrificados para la extracción de órganos 4 días después de la última inyección. Para el experimento de regeneración, después del bloqueo de IFNγ, se inyectó por vía intraperitoneal (ip) 5-fluorouracilo (5-FU) (150 mg/kg) o DMSO como control un día después de la última inyección y los ratones se sacrificaron para la extracción de órganos 7 días después.

Aislamiento de ARN y ADN.

El ARN total de las criptas se aisló utilizando el reactivo QIAzol Lysis (Qiagen) seguido de precipitación con isopropanol. ARN de Lgr5-eGFP^hi Las ISC clasificadas por FACS se aislaron utilizando el kit ZR-Duet™ DNA/RNA MiniPrep Plus (Zymo Research) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN aislado se cuantificó en Nanodrop 8000 (Thermo Fisher Scientific) y en Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific). La calidad del ARN aislado se analizó mediante Fragment Analyzer (Agilent).

Preparación de la biblioteca de secuenciación de ARN.

La preparación de la biblioteca de RNA-seq total empobrecida en ribo se realizó como se describió anteriormente⁶³. En resumen, se agotaron el ARN ribosómico de 50 a 500 ng de ARN total utilizando el kit Ribo-Zero™ Gold Kit H/M/R (illumina) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN empobrecido en ribo se resuspendió en 17 µl de tampón EFP (illumina), se calentó a 94 °C durante 8 minutos y se usó como entrada para la síntesis de la primera cadena, utilizando el kit de preparación de biblioteca de ARN TruSeq™ v2 (illumina) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Preparación celular para secuenciación de scRNA.

Según el experimento, las criptas proximales del intestino delgado o los organoides intestinales se resuspendieron en 1 ml de solución de aislamiento unicelular (TrypLE suplementado con 1 mg/ml de DNasa I, 5 mM de MgCl₂, 80 µM Y27632) y se incubaron durante 20 min a 37 °C con agitación breve en vórtice después de los primeros 10 min de incubación. La reacción se detuvo mediante la adición de 29 ml de PBS enfriado con hielo y las células se centrifugaron a 800 × g durante 5 min a 4°C. El sedimento celular se resuspendió en FSM suplementado con Y80 27632 µM. Las células se bloquearon previamente con el anticuerpo anti-ratón TruStain FcX de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Luego, las células se trataron con CD326 (EpCAM) (G8.8), anticuerpo monoclonal de rata acoplado a PE-cianina7 y diferentes anticuerpos Hashtag anti-ratón TotalSeq durante 30 minutos en hielo en la oscuridad. Luego las células se centrifugaron a 450 × g durante 5 min a 4 °C, se resuspendió en 500 µl de FSM fresco y se clasificó por FACS. EpCAM⁺ Se clasificaron por flujo células individuales de ratones jóvenes y viejos en un tubo recubierto de BSA que contenía 1.5 µl de PBS con BSA al 0.04%.

Lámina propia Se aislaron células inmunes del tejido intestinal proximal. Brevemente, después del aislamiento de la cripta, el tejido se cortó y se incubó en 3 ml de colagenasa D 1 mg/ml y DNasa I 1 mg/ml en medio RPMI suplementado con FBS al 2 % en una incubadora agitadora (80 rpm) durante 50 min a 37 °C. El tejido se pipeteó hacia arriba y hacia abajo varias veces con una punta p1000. El sobrenadante se pasó a través de un colador de 100 µm a medio RPMI suplementado con FBS al 2%. El tejido restante se rompió con el émbolo de una jeringa y se lavó con medio RPMI suplementado con FBS al 2% para recolectar el número máximo de células. El sobrenadante se centrifugó a 450 × g, 4°C durante 5 min. El sedimento se resuspendió en percoll al 40 % en medio RPMI suplementado con FBS al 2 %. La suspensión celular se pipeteó cuidadosamente sobre percoll al 80% en un tubo Falcon para crear un gradiente. Los tubos Falcon se centrifugaron a 1600 ×g, RT durante 20 min (rotura de centrífuga desactivada). Las células inmunes se recogieron cuidadosamente del límite de las dos concentraciones de percoll y se lavaron con PBS suplementado con FBS al 2%. La suspensión se centrifugó a 450 × g, 4°C durante 5 min. El sedimento se resuspendió en PBS suplementado con FBS al 2 % y se procedió a la tinción. Las células se bloquearon con anticuerpo anti-ratón TruStain FcX según las especificaciones del fabricante. La tinción y el etiquetado hash se realizaron al mismo tiempo con CD45 acoplado a FITC y diferentes anticuerpos Hashtag anti-ratón TotalSeq para cada compartimento. Los detalles sobre los anticuerpos se pueden encontrar en la tabla complementaria. S2.

Secuenciación de scRNA basada en gotas

scRNA-seq se realizó de acuerdo con los protocolos de 10X Genomics. Brevemente, la suspensión de células individuales preparada se mezcló cuidadosamente con una mezcla de transcripción inversa utilizando la química de perlas de gel y biblioteca 3' de Chromium Single Cell v2 (10x Genomics) y se cargó en un chip A de Chromium Single Cell (10x Genomics).

Durante el proceso de encapsulación en el sistema 10X Genomics Chromium, las células se lisaron dentro de la gota y liberaron ARN poliadenilado, que luego se unió a la perla con código de barras que se capturó con la célula. Siguiendo las pautas del manual de usuario de 10x Genomics, las gotas se sometieron directamente a transcripción inversa, se rompió la emulsión y se purificó el ADNc utilizando Dynabeads MyOne Silane (Thermo Fisher Scientific). Después de la amplificación por PCR del ADNc con ocho ciclos, se sometió a purificación y control de calidad en el Fragment Analyzer (Agilent).

El ADNc se fragmentó durante cinco minutos y se le colocó una cola dA, seguido de un paso de ligadura del adaptador y una PCR de indexación de 10 ciclos para generar bibliotecas. Después de la cuantificación, las bibliotecas se secuenciaron en la plataforma NextSeq500 (Illumina) utilizando una celda de flujo de alto rendimiento en modo PE (R1: 26 ciclos; I1: 8 ciclos; R2: 57 ciclos).

Secuenciación de alto rendimiento

Todas las muestras para experimentos de todo el genoma se secuenciaron en las plataformas HiSeq2500 y NextSeq500 (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.).

PCR cuantitativa en tiempo real

La síntesis de ADNc se realizó con 1 µg de ARN total utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (Biorad) según el protocolo del fabricante. El análisis de PCR cuantitativo en tiempo real se realizó en Corbett RotorGene 6000 (Qiagen) utilizando SYBR GreenER qPCR SuperMix (Thermo Fisher Scientific). Cada reacción se realizó en una mezcla de qPCR de 19 µl y 1 µl de 1∶10 ADNc diluido. Las condiciones de qRT-PCR fueron 10 min a 95 °C, luego 50 ciclos de 10 s a 95 °C, 10 s a 56 °C, 20 s a 68 °C y 3 s a 68 °C. Para obtener datos de amplicones, se realizó un análisis de la curva de fusión después de cada ejecución de PCR: cada muestra se analizó por triplicado. Las concentraciones de las muestras se calcularon utilizando el método de la curva estándar relativa. Todas las expresiones genéticas analizadas se normalizaron con respecto al gen de mantenimiento Beta-actina. Los cebadores se diseñaron utilizando la herramienta NCBI Primer-BLAST y sus secuencias se enumeran en la tabla complementaria S1.

Análisis de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) -qRT-PCR

La inmunoprecipitación de cromatina se realizó en organoides tratados y no tratados con IFNγ como se describió anteriormente.⁶³. Brevemente, los organoides tratados con IFNγ (2 ng/ml) durante 24 h se lavaron, se rompieron y se reticularon mediante la adición de formaldehído al 1 % durante 10 min a temperatura ambiente, se inactivaron con glicina 0.125 M durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego se lavó dos veces con PBS frío. Los organoides reticulados se resuspendieron en tampón SDS ChIP (Tris-HCl 20 mM, pH 8.0, EDTA 10 mM, SDS al 1 % e inhibidores de proteasa), se incubaron en un rotador durante 30 minutos a 4 °C, se sonicaron durante 18 ciclos a temperatura alta. ajuste de potencia (30 s encendido, 30 s apagado) usando el Bioruptor Next Gen (Diagenode) y centrifugado a 12,000 × g durante 10 min a 4°C. La cromatina aislada se diluyó 10 veces con tampón de dilución ChIP (Tris-HCl 16.7 mM, pH 8.0, SDS al 0.01%, Triton X-1.1 al 100%, EDTA 1.2 mM, NaCl 167 mM) y se incubó con 4 µg de anticuerpo durante la noche a 4 °C en un rotador. Se saturaron perlas magnéticas conjugadas con proteína G (Dynal, Thermo Fisher Scientific) con PBS/BSA al 1% y se sonicó esperma de salmón durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las muestras se incubaron con perlas saturadas durante dos horas a 4 °C en un rotador y posteriormente se lavaron con 1 ml de tampón frío bajo en sal (Tris-HCl 20 mM, pH 8.0, SDS al 0.1 %, Triton X-1 al 100%). , EDTA 2 mM, NaCl 150 mM), 1 ml de tampón rico en sal frío (Tris-HCl 20 mM, pH 8.0, SDS al 0.1 %, Triton X-1 al 100 %, EDTA 2 mM, NaCl 500 mM), 1 ml de líquido frío Tampón LiCl (Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, DOC al 1 %, LiCl 250 mM, EDTA 1 mM, NP-1 al 40%) y dos veces con 1 ml de tampón TE frío (Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, 1 mM). EDTA). La cromatina inmunoprecipitada se eluyó con 200 µl de tampón de elución (Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM, SDS al 1 %, NaCl 150 mM, DTT 5 mM) durante 30 min a temperatura ambiente en un rotador, y se desreticuló a 65°. C durante la noche. El ADN descruzado se purificó utilizando el kit de purificación por PCR QiaQuick (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El ADN inmunoprecipitado se analizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando SYBR GreenERkit (Invitrogen) y los siguientes cebadores: H2-Ab1 (adelante: CAGGTCCTGACCCCTGTTTA, reverso: GTTTCAGGAAGGGACAGCCA), Wars (adelante: CTGGCTGTGTAGTCCAAGGG, reverso: GAAAGGGTGTGGCAAAGCAG). Los anticuerpos utilizados para ChIP fueron: anti-Stat1 de conejo (9172, señalización celular), anti-IgG de conejo (12–370, Millipore). Todos los anticuerpos se utilizaron a una concentración de 1:250. Los detalles sobre los anticuerpos se pueden encontrar en la tabla complementaria. S2.

Inmunofluorescencia en secciones de tejido congelado.

Se fijó un trozo pequeño (2 cm) de intestino proximal (duodeno) en PFA al 4% en PBS durante la noche a 4 °C en un rotador. Después de la fijación, el tejido se lavó tres veces con PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego se deshidrató en sacarosa al 20% durante la noche a 4 °C en un rotador. Posteriormente, el tejido fijado se montó en un yeso utilizando un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT), se congeló lentamente con nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C. Para la tinción por inmunofluorescencia, se cortaron secciones de 14 µm y el tejido se permeabilizó en PBS suplementado con Triton X-0.1 al 100% durante 10 minutos y se lavó tres veces con PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. El tejido permeabilizado se bloqueó durante 1 h con FBS al 10 % en PBS suplementado con Tween 0.1 al 20 % (T-PBS) y luego se incubó con anticuerpo primario en T-PBS suplementado con FBS al 2 % durante la noche en una cámara húmeda a 4 °C. . Después de la incubación con el anticuerpo primario, el tejido se lavó tres veces con PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego se incubó con anticuerpo secundario en PBS suplementado con DAPI (1:1000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación con un anticuerpo secundario, el tejido se lavó tres veces con PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente y se montó. Las imágenes se realizaron en el Instituto Fritz Lipmann – Core Facility Imaging. Las imágenes se adquirieron utilizando el microscopio invertido Axiovert 200 con módulo deslizante ApoTome para corte óptico. Las imágenes se realizaron con un aumento total de 200x.

Los anticuerpos primarios utilizados para la inmunofluorescencia fueron: anti-EpCAM monoclonal de conejo [EPR20533-63] (Abcam; 1:250); MHC anti-ratón monoclonal de rata Clase II (IA) (NIMR-4), PE (Thermo Fisher Scientific; 1:250). Los anticuerpos secundarios utilizados para la inmunofluorescencia fueron: IgG anti-conejo de burro Alexa Fluor 488 (H + L) (Thermo Fisher Scientific; 1:500); IgG anti-rata de cabra Alexa Fluor 568 (H + L) (Thermo Fisher Scientific; 1:500). Los detalles sobre los anticuerpos se pueden encontrar en la tabla complementaria. S2.

Inmunofluorescencia en secciones de tejido incluidas en parafina

Se desparafinaron secciones de parafina de 5 μm mediante inmersión tres veces en xileno (5 minutos cada vez) y se rehidrataron mediante inmersión en una serie de diluciones graduadas de etanol al 100%, 90% y 70% durante 5 minutos cada una. La recuperación del epítopo se realizó precalentando las secciones durante 5 minutos en microondas a máxima potencia (900 W) en tampón citrato de sodio 10 mM, pH 6.5 hasta ebullición, seguido de 10 minutos a una temperatura de sub-ebullición (600 W). Después de enfriar durante 20 minutos, las secciones se lavaron en PBS y se bloquearon con BSA al 1%/PBS durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda. Las secciones se tiñeron con anticuerpos primarios: anti-Olfm4 (Cell Signaling, D6Y5A, #39141), anti-Muc2 (abcam, ab90007) y anti-Chga (abcam, ab15160) en BSA/PBS al 1 % durante 16 h a 4 grados. en cámara húmeda. A esto le siguió un lavado en PBST (Tween 0.1 al 20%, 3 x 5 min) y una posterior incubación durante 30 min con IgG secundaria anti-conejo conjugada con AF488. Todos los anticuerpos se utilizaron a una concentración de 1:250. Los portaobjetos se lavaron en T-PBS (Tween 0.1 al 20%, 3 x 5 min) y se montaron con medio de montaje que incluía DAPI. Las imágenes de las secciones teñidas se adquirieron utilizando Axio Imager de Zeiss y se analizaron mediante el software ZEN blue v2 (Zeiss). Para un mayor análisis de imágenes se utilizaron las herramientas gráficas para contar y medir del software ZEN. Los detalles sobre los anticuerpos se pueden encontrar en la tabla complementaria. S2.

Análisis de datos de secuenciación de ARN.

La verificación de calidad de los archivos Fastq se realizó con FastQC v0.11.5. Los archivos fastq se asignaron al genoma mm9 usando TopHat v2.1.0 con los siguientes parámetros –bowtie1 –no-coverage-search -a 5. El número de lecturas cubiertas por cada gen se calcula mediante HTSeq-Count 0.11.2 con -s no -a 0 -t exón -m intersección-parámetros no vacíos. Antes de realizar más análisis, todos los genes de ARNr se eliminan de los datos del recuento. Para calcular los DEG y el recuento normalizado, se utilizó el paquete DESeq2 R v1.20.0 con los parámetros predeterminados. Para el análisis de correlación de Pearson y el trazado de la expresión, se utilizó el recuento normalizado.

Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes

Para el análisis de enriquecimiento del conjunto de genes, los recuentos normalizados (para cada gen en todas las muestras) se escalaron utilizando la función de escala en R (con centro = VERDADERO, escala = parámetros VERDADEROS). El promedio de Z Las puntuaciones se calcularon para cada grupo y se utilizaron para dibujar diagramas y análisis posteriores. El p los valores se calcularon utilizando la prueba pareada de Wilcoxon (de dos colas). Los diagramas de caja muestran la distribución cuartil de los datos. Se mide una distancia de 1.5 veces el rango intercuartil (Q3-Q1) por debajo del cuartil inferior y se dibuja un bigote hasta el punto observado inferior del conjunto de datos que se encuentra dentro de esta distancia. Todos los demás puntos observados se trazan como valores atípicos.

Análisis de datos de secuenciación de scRNA para células de criptas intestinales

Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron con el comando 'contar' del software Cell Ranger (v2.1.0, 10X Genomics) con las opciones predeterminadas. La referencia requerida se construyó con el comando 'mkref' de Cell Ranger basado en el genoma murino mm10, así como la anotación genética de Ensembl (v87) como entrada. La anotación se filtró con el comando 'mkgtf' de Cell Ranger para incluir solo características de codificación de proteínas, lincRNA y genes antisentido ('–attribute=gene_biotype:protein_coding –attribute=gene_biotype:lincRNA –attribute=gene_biotype:antisense'). El archivo de recuento se cargó directamente en R utilizando el paquete cellrangerRkit v2.0.0. Antes de realizar más análisis de los datos del recuento, se eliminaron los genes no expresados ​​y los recuentos se normalizaron al número total de recuentos en cada celda (usando la función normalize_barcode_sums_to_median en el paquete cellrangerRkit) y se transformaron a log 10 para todos los análisis posteriores. El PCA se calculó utilizando la función prcomp con centro = VERDADERO,escala. = Parámetros VERDADEROS. La agrupación de las células se realizó mediante agrupación kmean (centro = 9, nstart = 10) y el tipo de célula de cada grupo definido se determinó utilizando los marcadores bien conocidos para cada tipo de célula. Usando 9 grupos, las células Tuft y Enteroendocrinas estaban en el mismo grupo, por lo que separamos estos tipos de células reagrupándolas usando kmean (centro = 2, nstart = 10). Para definir marcadores para cada grupo utilizamos order_cell_by_clusters y prior_top_genes (método = "sseq", min_mean = 0.1), respectivamente. La expresión de los marcadores se comparó entre el grupo deseado versus todas las demás células (usando la función prior_top_genes) y los genes con un cambio de log2 veces ≥ 2 y se ajustó p Se seleccionó como marcador un valor < 0.05.

Análisis de datos de secuenciación de scRNA para células inmunes de la lámina propia y células organoides intestinales

Se utilizó el paquete de software Cell Ranger (versión 3.1.0) para realizar la demultiplexación de muestras, el procesamiento de códigos de barras y el recuento de UMI 3' unicelular con mm10-3.0.0 como genoma de referencia. Las lecturas efectivas (UMI) por celda se escalaron al mismo nivel (recuentos UMI medios por celda: 1330) en cada muestra mediante la reducción de la muestra de las lecturas sin procesar. Las celdas con lecturas de hashtag se definieron en diferentes categorías de "hashtag único", "hashtag doble", "hashtag triple" y "hashtag múltiple" según la proporción de hashtag en cada celda. Las celdas con menos de 10 lecturas asignadas a hashtags se descartaron y solo se mantuvieron aquellas definidas como "hashtag único" para el análisis posterior. Posteriormente, la matriz de códigos de barras de genes de todas las muestras se integró con Seurat v3. Luego se aplicaron los siguientes criterios a cada célula, es decir, a las células inmunes: número de genes entre 200 y 1500, recuentos de UMI <5000 y recuentos normalizados de genes mitocondriales inferiores a 8; para células organoides intestinales: recuentos normalizados de genes mitocondriales por debajo de 20. Después del filtrado, un total de 8997 células inmunes restantes (4423 células para muestras jóvenes, 4574 células para muestras viejas) y 13,054 células organoides intestinales (5843 células para el grupo de control, 7211 células para grupo tratado con IFNγ) se dejaron para el siguiente análisis. El efecto por lotes se eliminó mediante la corrección del "análisis de correlación canónica (cca)" al integrar las células individuales de los organoides de control y los organoides tratados con IFNγ.

Reducción de dimensiones, agrupación de gráficos y visualización UMAP/t-SNE

Para las células inmunes, se selecciona un subconjunto de características (7425 genes) que exhiben una alta variación de célula a célula en el conjunto de datos con el método de "mvp" en Seurat (con un límite medio entre 0.0125 y 2; un límite de dispersión >0.9). que podría identificar características variables mientras se controla la fuerte relación entre la variabilidad y la expresión promedio. Básicamente, las características se dividieron en 20 contenedores según su expresión promedio, y z Las puntuaciones se calcularon para la dispersión dentro de cada contenedor.

Para las células organoides intestinales, se selecciona un subconjunto de características (2000 genes) que exhiben una alta variación de célula a célula en el conjunto de datos con el método de "vst" en Seurat. Los valores de las características se estandarizaron utilizando la media observada y la varianza esperada dada por el modelo de línea ajustada de log(varianza) y log(media). Luego, la variación de la característica se calcula sobre los valores estandarizados después de recortar al máximo.

Centrarse en genes variables en el análisis posterior ayuda a resaltar la señal biológica en conjuntos de datos unicelulares. Utilizamos de manera conservadora todos los genes variables identificados por el método "mvp" o "vst" para la reducción de dimensiones para garantizar que se mantuviera la mayor parte de la variabilidad en el conjunto de datos. PCA aplicó la reducción de dimensiones de la matriz de código de barras de genes aislados con hashtag filtrado en estos genes variables. Luego, se realizó una aproximación y proyección de colector uniforme (UMAP) para organoides intestinales y una incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (t-SNE) para células inmunes en los 20 componentes principales principales para visualizar las células. Mientras tanto, la agrupación basada en gráficos se ejecutó en datos de dimensiones reducidas con Seurat v3.

Análisis diferencial de grupos e identificación de genes específicos de grupos.

Para lograr el análisis diferencial se adoptó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon, tal como se implementó en Seurat v3. Para cada grupo, se generaron DEG en el envejecimiento con la expresión génica promedio en todas las células de cada grupo. De la misma manera, se comparó la expresión media de cada gen de cada grupo con la de las células de todos los demás grupos para identificar genes que están enriquecidos en un grupo específico. Se examinaron los primeros genes específicos de cada grupo en el rango según su diferencia de expresión en cada grupo. La expresión centrada de cada gen se utilizó para la visualización mediante mapa de calor. La clasificación de los subconjuntos de células inmunes se dedujo de la anotación de genes específicos del grupo. Se designaron manualmente diferentes tipos de células haciendo referencia a marcadores conocidos (Datos complementarios S4).

Pruebas de cambios en las proporciones celulares en células inmunitarias y organoides intestinales

Se calculó el odds ratio para representar el cambio en la abundancia relativa de cada tipo de célula durante el envejecimiento o el tratamiento. En estos dos conjuntos de datos se observaron cambios dramáticos en la frecuencia de algunos tipos de células. La importancia estadística de estos cambios se evaluó calculando, con respecto a cada comparación de condiciones y tipo de célula, la probabilidad hipergeométrica exacta (sin reemplazo) del cambio observado en el número de células.

Específicamente, dado que m y n células totales (de todos los tipos de células) se secuencian en una condición de tratamiento y control respectivamente, probamos, para un tipo de célula determinado, si el número de k y q de células observadas de tipo C en total y condición de tratamiento respectivamente, se desvía significativamente de un modelo nulo dado por la distribución hipergeométrica. La probabilidad de observar estos valores se calculó usando la función R 'phyper' del paquete 'stats', usando el comando: p = phyper(q, k, m, n) y se informó como hipergeométrico p valor. Los intervalos de confianza para el odds ratio se calcularon utilizando la función R 'fisher.test'.

Anotación funcional genética

DEG estadísticamente significativos (ajustados p valor <0.05) se cargaron en el software QIAGEN IPA para el análisis de vía canónica y regulador ascendente (Qiagen 2020, ver. 01/18/06). A partir de IPA se podrían recuperar vías enriquecidas y candidatos a reguladores ascendentes.

Predicción de motivos

La predicción del motivo se realizó mediante el software HOMER-v4.9.1 con una configuración de “-start −1000 -end 500 -len 8,10 -p 4 -b”. Se utilizó la distribución binomial para calcular p valores en los motivos enriquecidos. Se realizó un análisis de los promotores de los genes conocidos como marcadores de células secretoras en el intestino frente a los promotores de los genes conocidos como marcadores de enterocitos.

Estadística y reproducibilidad

No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra. No se excluyeron datos de los análisis. Los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos y la evaluación de resultados.

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de la cartera de naturaleza vinculado a este artículo.

• Distribución de relaciones públicas y contenido potenciado por SEO. Consiga amplificado hoy.
• PlatoData.Network Vertical Generativo Ai. Empodérate. Accede Aquí.
• PlatoAiStream. Inteligencia Web3. Conocimiento amplificado. Accede Aquí.
• PlatoESG. Carbón, tecnología limpia, Energía, Ambiente, Solar, Gestión de residuos. Accede Aquí.
• PlatoSalud. Inteligencia en Biotecnología y Ensayos Clínicos. Accede Aquí.
• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41467-023-41683-y