Modelos de ratón

Los animales de tipo salvaje y transgénicos utilizados para generar X-MET se alojaron en una habitación con temperatura controlada (22 °C) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de conformidad con las directrices de la Junta de Revisión Institucional de las instalaciones de animales de DIEM y el Instituto Nacional de Salud-Italia (n° 609/2015-PR; n° 864/2020-PR) y se informaron de acuerdo con las pautas ARRIVE.

Cultivos primarios y generación de X-MET

El cultivo primario de músculo y la generación de X-MET se realizaron siguiendo el protocolo detallado en Carosio et al.¹⁸. Se obtuvo una población heterogénea de células por disociación mecánica y enzimática de las extremidades traseras recolectadas de ratones de tipo salvaje (WT) o ratones transgénicos utilizando el kit de disociación del músculo esquelético de Miltenyi Biotech. Las células disociadas se filtraron a través de un filtro de células de 70 μm y se centrifugaron a 1200 rpm durante 15 min. Las células se resuspendieron en medio de crecimiento (GM) (DMEM, suero de caballo al 20 %, extracto de embrión de pollo al 3 %, HEPES 25 mM, HEPES 4 mM l-glutamina, gentamicina al 0.1%, penicilina/estreptomicina) y se sembraron durante 30 min dos veces seguidas para conseguir un enriquecimiento de mioblastos en el cultivo. Las células se resuspendieron y se sembraron a una concentración de 40,000 células/ml en una placa de cultivo de tejidos de 35 mm de diámetro recubierta con colágeno tipo I (Sigma) y se incubaron al 5 % de CO₂ a 37 °C. Después de 5 a 6 días de cultivo, se indujo la diferenciación de los mioblastos utilizando un medio de diferenciación (DM: DMEM, suero de caballo al 5 %, HEPES 25 mM, HEPES 4 mM l-glutamina, gentamicina al 0.1%, penicilina/estreptomicina). Después de 2 a 3 días de incubación con DM, se deslamina una monocapa de células primarias de músculo esquelético moviendo suavemente una punta estéril alrededor del área periférica de la placa. A continuación, la monocapa deslaminada se fijó en una placa recubierta de silicona (Sylgard, Dow Corning, Midland, Michigan) usando clavijas Minutiens de acero inoxidable de 0.20 mm de diámetro (Austerlitz INSECT PINS®). El X-MET se tensó a dos longitudes diferentes: + 0 %, que corresponde a la longitud de delaminación inicial (X-MET sin estirar), y 66 ± 1.5 % (+ 66 %) de la longitud de delaminación inicial (X-MET estirado). En estas condiciones mecánicas, X-MET se analizó a nivel morfológico, funcional y molecular después de 15 días en cultivo. En general, X-MET exhibe una estructura cilíndrica autoorganizada que contiene miotubos que laten y muestra, en promedio, un diámetro de 200 ± 12 mm y una longitud (después del estiramiento) de 2 ± 0.5 cm.

Mediciones de propiedades mecánicas X-MET

Al principio, la fuerza pasiva generada por el tejido durante el estiramiento se midió usando un actuador/transductor (Aurora Scientific Inc. 300B) para control de longitud y un transductor de microfuerza (Kronex AE801). Un software desarrollado en LabVIEW 2019 permitió la sincronización entre la señal de estiramiento y la medición de fuerza, así como la configuración de los parámetros de prueba. Partiendo de la longitud de delaminación inicial del tejido, el X-MET se estiró al 66 ± 1.5 % con una velocidad constante de 1 cm/min y, simultáneamente, se midió la fuerza pasiva generada por el tejido. Luego, la fuerza de contracción espontánea de X-MET se midió 15 días después de la delaminación de la construcción para las condiciones de X-MET estirado y no estirado. En detalle, un extremo del tejido se mantuvo fijo mediante los pines y el otro se conectó a un transductor de microfuerza (Kronex AE801). La actividad contráctil del músculo se adquirió durante 15 s a través de una placa de adquisición de datos de National Instruments (DAQ NI-PCI 6251) y un software desarrollado ad hoc en Labview 2019. Luego se calculó la frecuencia de contracción espontánea a través de la Transformada Rápida de Fourier (FFT). Durante toda la duración de la prueba de medición de fuerza, el X-MET se colocó en una placa de cultivo que contenía medio de diferenciación y se mantuvo a una temperatura de 37 °C, utilizando una placa de control de temperatura (Okolab srl, H401).

Extracción de ARN y PCR en tiempo real

La extracción de ARN total se realizó con TriReagentTM (SIGMA) y se retrotranscribió un microgramo de cada muestra de ARN con el kit de transcripción inversa QuantiTec (QIAGEN) para obtener ADNc de doble cadena. La PCR cuantitativa relativa se realizó en ABI PRISM 7500 SDS (Applied Biosystem, EE. UU.), utilizando un ensayo TaqMan marcado con 6-carboxifluoresceína (FAM) prefabricado para Hprt, Cx-43, TNNT2, β-MHC, PDE1C, IL-6, IL- 2, IL-4, IL-10, CCL2, COL3A1, CACNA 1C, RyR 2, α-MHC, ANP y BNP (Applied Biosystem, EE. UU.). El valor cuantitativo relativo de la muestra de RT-PCR se normalizó para la expresión de ARNm de Hprt. Para analizar miR-1 y miR-29b, el ARN extraído se retrotranscribió utilizando el KIT de transcripción inversa de micro-ARN (Applied Biosystem). La PCR cuantitativa relativa se realizó en ABI PRISM 7500 SDS (Applied Biosystem, EE. UU.), utilizando el ensayo TaqMan marcado con 6-carboxifluoresceína (FAM) prefabricado para miR1 (Applied Biosystem, EE. UU.). El valor cuantitativo relativo de la muestra de RT-PCR se normalizó para la expresión de U6 snRNA.

Análisis de secuencia de ARN

El ARN se aisló con Trizol de X-MET estirados después de 15 días en DM, X-MET no estirados y células primarias bidimensionales. Se envió un microgramo de ARN al Instituto de Genómica Aplicada (Udine, Italia) para una secuenciación profunda. Las bibliotecas de cDNA se procesaron de acuerdo con el protocolo estándar de Illumina y se secuenciaron con HiSeq2 (ejecución de 2500 plex, lecturas de 4 × 1 pb, aproximadamente 50 millones de lecturas/muestra). Las lecturas se alinearon con la versión UCSC mm30 del genoma del ratón usando Tophat10 (⁴⁰;v2.1.1), cuantificado con HTSeq-count (⁴¹; v0.5.4p5). El análisis de expresión diferencial se realizó en R (v3.5.1) utilizando DESeq2 (⁴¹; v1.20.0). Los datos de conteo de todas las condiciones se filtraron en función de su conteo sin procesar, conservando solo aquellos cuya suma de los conteos para todas las muestras fue superior a 1. El análisis de componentes principales (PCA) se basó en el 42 % de los genes más variantes entre las diferentes muestras. Los genes se consideraron expresados ​​​​diferencialmente con el valor p ajustado de Benjamini-Hochberg (FDR) <0.01.

Análisis de inmunofluorescencia

El análisis de inmunofluorescencia se realizó en secciones transversales y longitudinales de X-MET. Los X-MET se incrustaron en un medio de congelación de tejidos y se congelaron instantáneamente en isopentano enfriado con nitrógeno. Las muestras se montaron en un criostato y se cortaron en secciones de 10 μm de espesor. La sección se fijó con PFA al 4 %, se lavó en PBS con BSA al 1 % y Triton X-0.2 al 100 %, se preincubó durante 1 hora en suero de cabra al 10 % a temperatura ambiente y se incubó durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios: miosina pesada Cadena (MyHC) (Sigma-Aldrich), Conexina-43 (Cx-43) (Sigma-Aldrich) y Troponina cardíaca (Troponina I) (RV-C2 Hybridoma Bank). A continuación, las secciones se lavaron en PBS con Triton X-0.2 al 100 % y se incubaron con anticuerpo secundario (Alexa Fluor, Life Technologies) durante 45 min a temperatura ambiente. Los núcleos se tiñeron usando Pibenzimol bisbenzimida H33342 (HOECHST). Todos los análisis se realizaron con el software Zeiss Confocal (edición Zen 3.0 Blue).

Técnica de transferencia de tinte

El X-MET se lavó 2 veces con PBS libre de calcio y magnesio. Se preparó una mezcla de amarillo Lucifer CH (0.2 mg/ml) (Molecular Probes) y rodamina dextrano (0.5 mg/ml) (Molecular Probes) diluidos en medio de diferenciación. Para permitir que los tintes penetren en las células, la construcción se colocó en un portaobjetos que se preparó previamente para mantener el X-MET viable y crear una "cámara de incubación doble": en la cámara que contiene un extremo de la construcción X-MET, 50 µl de la mezcla detallada anteriormente, mientras que en la cámara que contenía el otro extremo se añadió medio de diferenciación para mantener húmedo el tejido. El X-MET se incubó así durante 10 min a 37 °C, 5 % de CO₂, se lavó con PBS tres veces y luego se analizó con microscopía confocal. Para verificar la viabilidad de X-MET y monitorear la transferencia del tinte, se realizó un análisis de lapso de tiempo. Las imágenes se adquirieron con un microscopio confocal Leica (barrido láser TCS SP2) equipado con láseres Ar/ArKr y HeNe, utilizando un objetivo 10X. La línea láser fue de 488 nm para la excitación de amarillo Lucifer y de 633 nm para la excitación de rodamina dextrano. La fluorescencia se recogió a 500/540 nm para el amarillo Lucifer ya 640/680 nm para la rodamina dextrano. La intensidad de la fluorescencia se calculó utilizando el software Leica.

Determinación de los niveles de calcio intracelular

Indicador FURA-2AM_ Para determinar el calcio intracelular [Ca²⁺]i Transitorio, X-MET sin estirar (X-MET 0 %) y X-MET estirado al 66 % de la longitud de delaminación inicial (X-MET 66 %) se cultivaron en placas de 35 mm y se incubaron en medio de cultivo que contenía 3.5 μmol/ L 2-[6-[bis[2-[(acetiloxi)metoxi]-2-oxoetil]amino]-5-[2-[2-[bis[2-[(acetiloxi)metoxi]-2-oxoetil]amino ]-5-metilfenoxi]etoxi]-2-benzofuranil]-5-oxazolcarboxílico (acetiloxi)metil éster (FURA-2-AM, Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU.) durante 30 min a 37 °C. Luego, el medio se enjuagó con solución salina balanceada de Hank (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.). Las placas se colocaron en una cámara de cultivo con el apoyo de un microscopio de fluorescencia invertido (Nikon TE2000E, Nikon Instruments, Italia), a 37 °C conectado a una cámara refrigerada con dispositivos de carga acoplada (cascada 12B, Roper Scientific, Ottobrunn, Alemania). Se usó un monocromador de acceso aleatorio para iluminar muestras alternativamente a 340 y 380 nm (Photon Technology International, New Jersey, EE. UU.) y la emisión se detectó usando un filtro de emisión de 510 nm. Se utilizó el software Metafluor® (Universal Imaging Corporation, Downington PA, EE. UU.) para adquirir las imágenes. Al final de cada experimento, la calibración se obtuvo aumentando al máximo el Ca intracelular²⁺FURA-2-AM dependiente de fluorescencia con 5 μmol/L de ionomicina (sal de calcio de ionomicina de Streptomyces conglobatus, Sigma) seguida de un registro de fluorescencia mínima en un Ca²⁺-medio libre⁴².

Indicador INDO-1AM_INDO-1 AM (Invitrogen I1226) se reconstituyó en DMSO recién abierto de alta calidad a una concentración de 1 mM y se usó a una concentración final de 100 μM en Ca²⁺/ Mg²⁺ PBS gratuito. Una vez reconstituido, se protegió de la luz y se almacenó a -20 °C para evitar congelaciones-descongelaciones. Las muestras (X-MET 0% 15 DM y X-MET 66% 15 DM) se lavaron tres veces en PBS. Luego, se agregó INDO-1 AM lentamente a lo largo de las construcciones musculares y las muestras se incubaron durante 30 min a 37 °C. Al final, los X-MET se lavaron con PBS tres veces y se analizaron con microscopía confocal. La detección se realizó considerando la doble emisión de INDO-1 que se desplaza de 475 nm en Ca²⁺-medio libre a 400 nm cuando el tinte está saturado con Ca²⁺⁴³. Todos los análisis se realizaron con el software Zeiss Confocal (edición Zen 3.0 Blue)⁴³.

Extracción de proteínas y Western Blot

Las muestras se homogeneizaron en tampón de lisis (Tris-HCL, pH 7.5/20 mM, EDTA/2 mM, EGTA/2 mM, Sacarosa/250 mM, DTT/5 mM, Triton-X/0.1 %, PMSF/1 mM, NaF /10 mM, SOV4/0.2 mM, cóctel de inhibidores de la proteasa/1x (Sigma-Aldrich). Se separaron cantidades iguales de proteína (70 μg) de cada lisado (previamente cuantificado a través del ensayo de Bradford) en gel de poliacrilamida SDS (4–15 % CriterionTM TGX Stain-FreeTM Protein Gel, Bio-Rad) y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (paquete de transferencia Trans-Blot Turbo, Bio-Rad) utilizando el sistema de transferencia Trans-Blot ® TurboTM (programa: 2.5 A, 25 V, 20 min). Luego, la membrana se tiñó con Ponceau (0.005 % en ácido acético al 1 %) como control de carga intermedia, luego se bloqueó con leche descremada en polvo al 5 % en TBS-Tween al 1 % durante 1 h a temperatura ambiente y luego se incubó durante la noche a 4 ºC. °C con un anticuerpo primario para Cx-43 (Sigma-Aldrich).Luego, la membrana se lavó cuatro veces durante 5, 15, 15 y 5 min en TBS-1% Tween, luego se incubó con un anticuerpo secundario específico conjugado con peroxidasa para 45 minutos a temperatura ambiente. Después de tres lavados de 10 min con TBS-Tween al 1%, la membrana se analizó mediante el sistema de quimioluminiscencia mejorado (ChemiDoc Imaging System, Bio-Rad) según las indicaciones del fabricante. La señal adquirida se cuantificó mediante densitometría de barrido utilizando un sistema de análisis de bioimagen (Image LabTM Software). Los resultados se expresan como intensidad integrada relativa en comparación con los controles (GAPDH), después de restar sus respectivos fondos.

Configuración experimental de AFM y análisis de datos

Las mediciones de elasticidad se realizaron utilizando el microscopio de fuerza atómica Bruker Dimension Icon (Bruker, Santa Barbara, CA) equipado con el soporte de sonda para operar en un entorno fluido. Las muestras se mantuvieron clavadas en una placa de Petri cubierta con una capa de PDMS para mantener las clavijas en posición; durante todas las mediciones, las muestras no se adhirieron a la superficie del PDMS. Las mediciones se realizaron en tampón fisiológico utilizando puntas MLCT-BIO de Bruker, con constantes elásticas (calibradas en aire, con el método de ajuste térmico⁴⁴, antes de iniciar cada experimento) que sigue en el rango 0.0065 ± 0.0005 N/m. Cada muestra ha sido medida mediante mapas de Fuerza Volumen de 16 × 16 curvas de fuerza, a la velocidad de 3 curvas de fuerza por segundo, en varias áreas diferentes de 100 micras cuadradas cada una. Se ha realizado una selección manual previa (por inspección visible) de las curvas de fuerza utilizando el software Bruker NanoScope Analysis (Bruker, Santa Barbara, CA), con el fin de excluir del análisis aquellas curvas que presenten una señal perturbada por la contracción. de la muestra El valor de calibración de rigidez (también llamado sensibilidad del detector) se ha obtenido mediante la adquisición de curvas de fuerza en una placa de Petri prístina. Luego de estos pasos preliminares, se analizaron las curvas de fuerza mediante el software FC_analysis, cuyo funcionamiento completo se describe en Dinarelli et al.⁴⁵. El valor del módulo de Young se ha obtenido ajustando las curvas con un modelo hertiano considerando el coeficiente de Poisson de las muestras de 0.5 y una punta cónica con semiángulo de apertura de 35°. El número total de curvas de fuerza incluidas en el análisis son 700 y 1200 para el X-MET no estirado y el X-MET estirado al 66 %, respectivamente. Las elaboraciones estadísticas y gráficas se han llevado a cabo utilizando el software Origin (OriginLab, Northampton, MA).

Implantación de X-MET en infarto de miocardio

Se anestesiaron ratones C57BL/6J de tres meses de edad con isoflurano (IsoFlo®) 1.35% + 2% O₂. Bajo visión microscópica realizamos una incisión cervical en la línea media separando la piel, el músculo y el tejido que recubre la tráquea. Introducimos el tubo endotraqueal sujetando la parte craneal de la tráquea mediante micro pinzas quirúrgicas. La frecuencia respiratoria fue de aproximadamente 110 por minuto, con una presión inspiratoria de 17 a 18 cm H₂O. Posteriormente, la oclusión de la arteria descendente anterior izquierda (LAD) se realizó con una sutura permanente de prolene 8-0 (Ethicon, Norderstedt, Alemania), con un tubo de silicona (1 mm OD) colocado en la parte superior de la LAD, 2 mm debajo del límite entre la aurícula izquierda y el VI⁴⁶. Durante la operación, los ratones fueron monitoreados con una sonda rectal para mantener la temperatura corporal entre 36.8 y 37.2 °C usando una almohadilla térmica. El tórax se cortó horizontalmente en el cuarto espacio intercostal. Eventualmente, un extremo del X-MET se fijó a través de un segundo nudo de ligadura en el sitio del daño al mismo tiempo que se realizaba la cirugía de ligadura de la LAD. La implantación se realizó asegurándose de que el sitio dañado estuviera completamente cubierto por la construcción X-MET y el procedimiento se finalizó reubicando cuidadosamente el pericardio por encima de la pared del corazón. Luego, se cerró el tórax con sutura de polipropileno 5-0. Los X-MET se obtuvieron de ratones consanguíneos C57BL/6J y ratones UBC/GFP excluyendo el uso de fármacos inmunosupresores. Cuarenta y cien días después de la LAD, se realizaron análisis ecocardiográficos e histológicos para evaluar la isquemia y el remodelado miocárdico.

Análisis histológico

Se fijaron corazones enteros con formalina al 10% y se seccionaron a intervalos de 1 mm. Cada portaobjetos tenía 10 secciones, que comenzaban en el vértice y terminaban en el sitio de ligadura de la sutura (aproximadamente 6 portaobjetos). Cada portaobjetos se tiñó con tricrómico de Masson para identificar áreas de fibrosis o se tiñó con hematoxilina y eosina (H&E). Para evaluar la integridad de la membrana de la fibra muscular, los ratones recibieron la inyección intravenosa (iv) de colorante azul de Evans (EBD, 10 mg/mL, Sigma) en PBS a la dosis de 0.1 mg/g de peso corporal. Cada ratón experimental se sometió a natación continua de 20 minutos después de la inyección de colorante. Las muestras de músculo se recogieron 24 h después de la inyección. EBD se une a la albúmina y se observó bajo el microscopio fluorescente.

Análisis de ecocardiografía

Para la ecocardiografía se utilizó una plataforma de imágenes digitales de alta resolución y alta frecuencia con tecnología de matriz lineal y modo Doppler color para microimágenes de alta resolución in vivo (Vevo® 3100 Imaging System, FUJIFILM VisualSonics Inc., Toronto, Canadá). Para evaluar la función cardiovascular de los ratones, un cardiólogo experto utilizó una sonda transductora de alta frecuencia (VisualSonics MS400, FUJIFILM VisualSonics, Inc., Toronto, Canadá, con un rango de frecuencia de 18 a 38 MHz) bajo la supervisión de un veterinario. 4–5 semanas después de la cirugía, los ratones fueron anestesiados usando (IsoFlo®) 1.35% + 2% O₂ afeitado y colocado sobre una superficie calentada eléctricamente. Se estudiaron los grosores y diámetros de las paredes ventriculares mediante ecocardiografía en modo M y se calculó la fracción de acortamiento. La temperatura corporal de los ratones se controló utilizando una sonda rectal y la frecuencia cardíaca se utilizó como parámetro de validación, excluyendo del estudio a los ratones bradicárdicos (es decir, < 400 lpm). Una vez que se completó la caracterización funcional, el ratón anestesiado fue sacrificado por dislocación cervical y se recolectó tejido para análisis histológico y bioquímico.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism Software. Todos los datos se expresan como media ± SEM De acuerdo con los diferentes datos analizados, se realizaron los siguientes análisis estadísticos: pruebas no paramétricas (prueba de suma de rangos de Mann Whitney) y prueba ANOVA de 1 vía (prueba post-hoc de Bonferroni, prueba de comparación múltiple de Tukey y prueba LSD de Fisher). Las diferencias se consideraron significativas para un valor de p ≤ 0.05 (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001).

• Distribución de relaciones públicas y contenido potenciado por SEO. Consiga amplificado hoy.
• PlatoData.Network Vertical Generativo Ai. Empodérate. Accede Aquí.
• PlatoAiStream. Inteligencia Web3. Conocimiento amplificado. Accede Aquí.
• PlatoESG. Automoción / vehículos eléctricos, Carbón, tecnología limpia, Energía, Ambiente, Solar, Gestión de residuos. Accede Aquí.
• Desplazamientos de bloque. Modernización de la propiedad de compensaciones ambientales. Accede Aquí.
• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41598-023-37553-8