Todos los reactivos se utilizaron tal como se recibieron a menos que se indique lo contrario. Todos los productos químicos se adquirieron de Sigma Aldrich, excepto las perlas de conteo (CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen). ζ-El potencial se midió utilizando un Zetasizer NanoZS90 (Malvern Instruments). El tamaño y la morfología de las partículas se estudiaron mediante SEM en un microscopio JEOL JSM 7800F Prime con EDS integrado para proporcionar el análisis elemental. El tamaño de partícula se determinó midiendo 50 partículas independientes. La cromatografía radioeléctrica instantánea en capa fina (ITLC) se desarrolló en papel de cromatografía de microfibra de vidrio de Agilent Technologies impregnado con ácido silícico y se analizó utilizando un escáner Lablogic Flow-count TLC y un detector de tubo fotomultiplicador (PMT) BioScan B-FC-3200 utilizando el software Laura. La fase móvil de ITLC estaba compuesta de ácido cítrico 0.175 M y citrato trisódico 0.325 M en agua, a menos que se indique lo contrario. Las muestras radiactivas se midieron utilizando un Capintec CRC-25R (Capintec) o un LKB Wallac 1282 Compugamma CS (PerkinElmer) para los cuales los datos se recopilaron utilizando el software EdenTerm. Los experimentos de citometría de flujo se llevaron a cabo en un clasificador de células BD FACSMelody utilizando el software BD FACSChorus. Las imágenes PET/CT se adquirieron utilizando un escáner NanoPET/CT (Mediso), se reconstruyeron utilizando el software Nucline v.0.21 y las imágenes se analizaron utilizando el software VivoQuant (versión 3.5, InviCRO). Los datos en modo lista se obtuvieron mediante una herramienta de software MATLAB específica desarrollada por Mediso. La autorradiografía se realizó en un instrumento GE Amersham Typhoon.

Síntesis de partículas de sílice de tamaño submicrométrico.

Las partículas se sintetizaron mediante el método de Stöber. Este método se basa en la hidrólisis y condensación consecutiva de alcóxidos de silicio para producir partículas de sílice esféricas y monodispersas.²⁷. Se utilizó ortosilicato de tetraetilo (TEOS) como fuente de silicio, amoníaco como catalizador base y cloruro de potasio como electrolito. Se añadió continuamente una solución de TEOS en etanol a una solución que contenía el catalizador y el electrolito. La modificación de la cantidad inicial del reactivo o la tasa de adición proporciona diferencias en el tamaño de partícula como se informó anteriormente.²⁸. Aquí, se prepararon dos soluciones antes de la síntesis de las partículas: la Solución 1 que contiene 19.0 mmol de TEOS en 33.3 ml de EtOH y la Solución 2 que contiene 0.23 mmol de KCl en 9 ml de amoniaco, 65 ml de EtOH y 6.75 ml de H₂O. Para la síntesis, la Solución 2 se colocó en un matraz de fondo redondo de 250 ml calentado a 50 °C con agitación a 300 rpm durante 15 min. Luego, se añadió gota a gota la Solución 1 a la Solución 2 (tasa de suministro 0.2 ml min^-1). Después de la adición de la Solución 1, las partículas obtenidas se purificaron por centrifugación a 18,300g durante 3 min y se lavó con EtOH cinco veces. Finalmente, el SiO₂ Las micropartículas se secaron al vacío.

Injerto de partículas de tamaño submicrométrico con silano-PEG_5k

20 mg ml^-1 solución de silano-PEG_5k (Sigma Aldrich) en EtOH al 98% sobre una solución de smSiP a 5 mg ml.^-1 en EtOH 98% y 2.8% de amoniaco. La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente y las partículas se recuperaron mediante centrifugación a 18,300g durante 3 min. Finalmente, las partículas se lavaron tres veces con agua destilada y se secaron al vacío durante la noche. Las soluciones de lavado se liofilizaron durante la noche y la cantidad de silano-PEG no adherido_5k ponderado para el cálculo del rendimiento de la reacción. 0.05 mg ml^-1 solución de smSiP-PEG_5k en agua destilada se empleó para reacciones adicionales de radiomarcaje.

[⁶⁸Ga]GaCl₃

El galio-68 se eluyó como [⁶⁸Ga]GaCl₃ de un Eckert y Ziegler ⁶⁸Ge /⁶⁸Generador de Ga en HCl ultrapuro (4 ml, 0.1 M) fabricado según los requisitos de buenas prácticas de fabricación (ABX).

Concentración del [⁶⁸Ga]GaCl₃ elución por intercambio catiónico

La concentración de la elución se llevó a cabo utilizando la configuración descrita en la Fig. 1. Primero, los 4 ml del [⁶⁸Ga]GaCl₃ La elución se cargó en un cartucho Strata-X-C 33u (Phenomenex) y el eluato se descartó. Luego, el cartucho se lavó con 5 ml de una solución de acetona/HCl 0.1 M (80:20) y se descartó el eluato. Finalmente, el concentrado [⁶⁸Ga]GaCl₃ se recogió añadiendo 700 µl de una solución de acetona/HCl 0.05 M (98:2), se secó en una atmósfera de N₂ corriente y se resuspendió en 50 µl de tampón HEPES 0.5 M (pH 4.9). Se realizó Radio-TLC en las diferentes etapas para el control de calidad. El protocolo dura aproximadamente 20 min y proporciona un rendimiento de recuperación del 86.2 ± 8.5 %.

Radiomarcaje de partículas de sílice a diferentes concentraciones con ⁶⁸Ga

Las partículas de sílice se resuspendieron a diferentes concentraciones (de 1 a 0.002 mg ml^-1) en tampón HEPES 0.5 M (pH 4.9). Luego, se agregaron 50 µl de la solución a un tubo de reacción antes de agregar el concentrado [⁶⁸Ga]GaCl₃ elución en 50 µl de tampón HEPES 0.5 M (pH 4.9). Las reacciones se llevaron a cabo a 90 °C durante 30 min y se realizó radio-TLC para calcular el rendimiento radioquímico.

Medición de la concentración de partículas mediante citometría de flujo.

Las concentraciones de partículas se calcularon mediante citometría de flujo utilizando perlas de conteo (CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las partículas de sílice se resuspendieron a 0.05 mg ml.^-1, se sonicó durante 10   min y se pasó a través de un filtro de tamaño de corte de 10   µm (filtro de jeringa KX, nailon, 25   mm, 10   µm). Las perlas de conteo absoluto CountBright se calentaron a temperatura ambiente y se agitaron durante 30 segundos. Luego, se agregaron 50 µl de perlas a 300 µl de partículas de sílice y la mezcla se agitó durante 30 minutos para obtener una solución homogénea. La muestra se procesó en el citómetro de flujo y el umbral de dispersión directa (FSC) se configuró para incluir las perlas y las partículas en el diagrama de dispersión lineal-FSC versus lineal-lateral. Posteriormente, se ajustó el voltaje del detector de fluorescencia para las perlas de conteo y se realizó una estrategia de activación para aislar las partículas de sílice y las poblaciones de perlas de conteo. Finalmente, se dibujaron puertas en las partículas y las perlas de conteo absoluto y se registraron 1,000 eventos de perlas para cada muestra. Usando esta estrategia, el número de partículas en solución se calculó usando la siguiente ecuación:

Radiomarcaje de 500 smSiP

Se agregaron quinientos smSiP a 50 µl del concentrado [⁶⁸Ga]GaCl₃ elución en tampón HEPES 0.5 M pH 4.9. Luego, se agregaron 5.6 µl de polisorbato 80 y la mezcla se calentó a 90 °C durante 30 min a 900 rpm en un mezclador térmico. Posteriormente, se diseñó un protocolo final de purificación de varios pasos para eliminar los coloidales/sin reaccionar. ⁶⁸Ga. Se añadieron cincuenta microlitros de EDTA 10 mM y la mezcla se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego, las partículas se centrifugaron durante 3 min a 18,300g, se resuspendió en 500 µl de PBS que contenía EDTA 1 mM + polisorbato 0.1 al 80 % y se agitó suavemente durante 10 s. Las partículas se centrifugaron nuevamente, se lavaron con una solución de EDTA 0.1 mM + polisorbato 0.1 al 80 % en PBS y se agitaron suavemente durante 10 s. Finalmente, las partículas se centrifugaron y se lavaron cinco veces más con PBS + polisorbato 0.1 al 80% y se resuspendieron en 500 µl de PBS. La reacción de radiomarcado se monitorizó mediante radio-TLC durante los sucesivos pasos de reacción para evaluar la presencia de coloides (que pueden confundirse con partículas si no se eliminan adecuadamente), el radiomarcado de las partículas y la pureza del producto final. El RLY se calculó comparando la cantidad de radiactividad en las partículas y los sobrenadantes después de las etapas de lavado.

Fraccionamiento

Para la estrategia de fraccionamiento, volúmenes de 0.5 μl a 20 μl del ⁶⁸Ga-smSiP a una concentración teórica de 1 partícula μl^-1 Se agregaron a diferentes tubos de muestra en pasos de 1 μl (0.5, 1, 2, 3…) y se agregó PBS para llevar el volumen final a 50 μl. Luego, se pipetearon 37.5 µl del primer tubo a un segundo tubo de muestra, 25 µl del segundo tubo a un tercer tubo y finalmente 12.5 µl del tercer tubo a un cuarto tubo. Esta estrategia proporciona cuatro tubos por muestra con un volumen final de 12.5 µl por tubo. La radiactividad en cada tubo se midió en un contador gamma y los valores se calcularon en kBq utilizando una curva de calibración, para su posterior comparación y análisis. Las muestras que contenían la mayor parte de la radiactividad en un solo tubo se sonicaron durante 30 segundos a temperatura ambiente y se sometieron a un segundo paso de fraccionamiento. Luego, las muestras en las que se encontró toda la radiactividad en un solo tubo (con actividad insignificante en los otros tres tubos) se usaron para experimentos adicionales in vivo/ex vivo.

Imagen fantasma PET/CT

Se llevó a cabo un experimento de imágenes fantasma con uno ⁶⁸Ga-smSiP. Se usó una cánula para administrar la partícula en un tubo de muestra para evaluar si una sola partícula podría permanecer atrapada en el tubo de la cánula durante la administración. Brevemente, el tubo fantasma se colocó en el escáner nanoPET/CT con el extremo de la punta de la cánula unida al tubo. Después de iniciar la adquisición de PET, la partícula resuspendida en 100 µl de PBS se administró con una jeringa de insulina unida al comienzo de la cánula. Luego, la cánula se lavó con 50 µl de PBS para asegurar la entrega de la partícula al tubo fantasma. La adquisición de PET se realizó durante 2 h seguida de una tomografía computarizada estándar.

Imágenes PET/CT in vivo

Los estudios de imágenes de animales se revisaron éticamente y se llevaron a cabo de acuerdo con las regulaciones del Ministerio del Interior del Reino Unido de la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 (ASPA) que rigen la experimentación con animales. Las imágenes in vivo se realizaron en ratones BALB/c sanos de 8 semanas de edad. Los animales fueron anestesiados con isoflurano (2-3% en oxígeno), canulados y colocados en la cama del escáner bajo anestesia. La cama se calentó a 37°C mediante un flujo de aire interno para mantener al animal a una temperatura corporal normal, y la frecuencia respiratoria se monitorizó y mantuvo entre 60 y 80 respiraciones por minuto.^-1 durante todo el escaneo. Mantener el control sobre la temperatura del animal es importante, ya que una caída inesperada de la temperatura podría provocar una reducción en la velocidad de la partícula en la sangre. Uno ⁶⁸Ga-smSiP (n = 4) o ⁶⁸Ga-smSiP-PEG_5k partícula (n = 2) se administró a través de la cánula en 100 μl de PBS, seguido de un lavado con 50 μl de PBS después de iniciar la adquisición de PET (modo de coincidencia 1:5; ventana de tiempo de coincidencia de 5 ns). Se registró PET durante 2 h y luego se realizó una tomografía computarizada semicircular. Durante todo el proceso se monitorizó la temperatura corporal de los animales y la frecuencia respiratoria. Las imágenes dinámicas de PET/CT se reconstruyeron utilizando la reconstrucción 3D de Tera-Tomo (ventana de energía de 400 a 600 keV, modo de coincidencia 1:5, 20 iteraciones y 1 subconjunto) con un tamaño de vóxel de 0.4 × 0.4 × 0.4 mm.³ y corregido por atenuación, dispersión y decaimiento. Los datos en modo de lista para todas las adquisiciones de PET/PEPT se pueden encontrar para ⁶⁸Ga-smSiP en la ref. ²⁹ y para ⁶⁸Ga-smSiP-PEG_5k en la referencia. ³⁰.

Seguimiento en tiempo real

Primero, los datos se exportaron desde el escáner en formato de modo de lista (es decir, un formato con una marca de tiempo y un índice de cristal para los fotones coincidentes detectados). Se aplicó una transformación geométrica para convertir de índices de cristal a posición en unidades de mm. El método de Birmingham calcula iterativamente el MDP a partir de un subconjunto de todos los LoR. Para ello, descarta los LoR que están a más de una distancia establecida del MDP, ya que es probable que surjan de LoR falsos, por ejemplo, los LoR que pueden originarse por dispersión. El MDP se perfecciona con cada iteración; El número de iteraciones lo establece efectivamente el f-factor y se relaciona con el número total de LoR que se utilizan para estimar la posición final de la partícula dentro de ese subconjunto (por ejemplo, un f-factor de 0.5 significa que el ciclo de iteración terminará cuando quede el 50% de los LoR en el subconjunto). El número de LoR utilizados en un subconjunto se puede reducir para mejorar el muestreo temporal (los subconjuntos son consecutivos en el tiempo sin superposición) a costa de aumentar la incertidumbre en la posición (se pueden encontrar más detalles del algoritmo en Parker et al.⁵) Se utilizó el método de Birmingham para analizar datos en modo lista del escáner PET. Se utilizó un tamaño de muestra adaptativo para rastrear la partícula en los ratones. El tamaño de la muestra se estableció para lograr un equilibrio de muestreo temporal suficiente y al mismo tiempo minimizar los errores de posicionamiento. Se utilizó un tamaño de muestra de entre 100 y 200 LoR en las primeras etapas de los escaneos (<60 s desde el inicio del escaneo), con f = 0.1, lo que produce intervalos de aproximadamente 1 a 5 s. En tiempos de escaneo >60 s, los tamaños de muestra variaron entre 1,000 y 2,000, lo que produjo intervalos de tiempo de entre 30 s y 60 s dependiendo del experimento in vivo. El número de recuentos utilizados para calcular el MDP (en la iteración final) se puede encontrar multiplicando el tamaño de la muestra por el f-valor del factor. Estos parámetros se basaron en experiencias previas y se informaron en publicaciones anteriores.¹.

La velocidad se obtuvo como (cuadrado{{v}_{x}^{2}+{v}_{y}^{2}+{v}_{z}^{2}}) donde ({v}_ {m}^{2}) es la velocidad en el x, y y z direcciones.

Captación de órganos ex vivo

La captación en diferentes órganos se evaluó mediante conteo gamma. Después de las imágenes PET/CT in vivo, se sacrificaron los animales mediante dislocación cervical y se extirparon los órganos y se pesaron para contar la radiactividad en un contador gamma (LKB Wallac 1282 Compugamma CS). Los datos se expresaron como porcentaje de dosis inyectada (dosis en el órgano/dosis total inyectada) por gramo de tejido (%ID g^-1).

Autorradiografía

La radiactividad en los pulmones se rastreó con un detector de radiación (sonda EP15, Morgan) y los pulmones se cortaron en pequeñas secciones con un bisturí hasta obtener una pequeña porción de tejido con la señal radiactiva. El tejido se congeló instantáneamente en isopropanol a -80   ° C. Inmediatamente después de la congelación, el tejido se incrustó en un medio de temperatura de corte óptima y se cortó en un criostato en rodajas de 20 µm. Cada corte fue examinado con el detector hasta que se encontró el corte radiactivo. El corte anterior (debajo del fondo), radiactivo y el siguiente (debajo del fondo) se colocaron en un portaobjetos de microscopio Superfrost (Epredia). El resto del tejido restante también estaba por debajo del fondo. El portaobjetos de microscopio con las tres secciones se cubrió con una película adhesiva y se colocó frente a una placa de autorradiografía GE durante la noche. La placa se analizó utilizando GE Amersham Typhoon con una resolución de 25 µm y un ajuste de PMT de 4,000. La imagen de la autorradiografía se superpuso a la imagen del tejido, mostrando un punto de radiactividad en el corte radiactivo. Para la cuantificación, se prepararon estándares en diferentes actividades conocidas, y cada uno se identificó como un quinteto de 1 μl en papel. Las manchas se incubaron en el mismo tamiz de fósforo de almacenamiento, BAS-IP MS (estándar multipropósito) de GE, mientras se cuantificaban las partículas individuales. La imagen fue adquirida con el Amersham Typhoon 5 con el software de control versión 2.0 en modo fósforo con un tamaño de píxel de 100 μm y una sensibilidad de 4,000. Las imágenes se cuantificaron con el software ImageQantTL v10.0-261 utilizando la caja de herramientas de cuantificación en gel. Las manchas se corrigieron eligiendo una región inmediatamente anterior o posterior a la mancha como fondo constante. El volumen resultante de la mancha se utilizó para calcular el Bq en la partícula basándose en la curva de calibración.

Estadística y reproducibilidad

Para el análisis cuantitativo, se analizaron un mínimo de tres réplicas biológicas excluyendo los datos in vivo de ⁶⁸Ga-smSiP-PEG_5k (n = 2). Los datos se analizaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) ordinario con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett y la prueba de Student. t-prueba. A P un valor <0.05 se consideró estadísticamente significativo.

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01589-8