La mutación NPM1 reprograma la red de transcripción leucémica a través de la remodelación de la topología TAD - Leucemia

Mutación de NPM1 da como resultado el secuestro citoplasmático de NPM1^C+ proteína que mantiene un patrón de expresión único de HOXA/B genes y MEIS1 oncogén al unirse directamente a los sitios diana de la cromatina para facilitar la leucemogénesis de la AML.1,2,3]. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes NPM1^C+Las redes reguladoras de genes impulsadas por genes y la leucemogénesis siguen siendo esquivas. Desde tipo salvaje (WT) NPM1/NPM1^C+-se asocia con CTCF y puede influir en los bucles mediados por CTCF mediante el anclaje para el clúster de CTCF [4, 5], se ha especulado durante mucho tiempo que NPM1^C+ la mala localización puede alterar la expresión génica mediada por CTCF. Probamos si la mala localización de NPM1^C+ al citoplasma altera los dominios asociados topológicamente tridimensionales (3D) mediados por CTCF (TAD) por Hi-C comparando Lin de médula ósea (BM) de ratón^–cKit⁺ (LK) células madre y progenitoras enriquecidas purificadas de WT y NPM1^C+-KI animales inducidos para NPM1^C+ expresión para 4 meses (Tabla S1 kits, construcciones, células, anticuerpos enumerados). Ratones que expresan condicionalmente NPM1^C+ en la MO desarrollan una neoplasia mieloproliferativa/una afección similar a la mielodisplasia con una latencia prolongada caracterizada por agrandamiento del bazo, leucocitosis y trombocitopenia.6, 7]. Confirmamos que NPM1^C+ cKI activado de forma aberrante Hoxa/hoxb y Meis1 genes que coincidieron con una ganancia de accesibilidad a la cromatina como se ve en RNA-seq y ATAC-seq (Fig. S1A, B) [1, 8]. NPM1^C+ expresión condujo a un aumento de 46 TAD y una disminución de 31 TAD (Fig. 1A). Los TAD aumentados abarcaron 434 genes de los cuales aproximadamente el 18% (78 genes) se superpusieron con genes que aumentaron en expresión al NPM1^C+-cKI medido por RNA-seq (Fig. 1B, arriba). Estos genes superpuestos son principalmente NPM1^C+-genes característicos implicados en las vías que regulan la transcripción, el patrón anterior/posterior, los genes homeobox y el ciclo celular (fig. 1C, arriba). Top TADs fortalecidos por la NPM1^C+–cKI incluido Hoxa/by Pbx3 lugares (Fig. 1D-F). Muchos de estos genes están específicamente involucrados en NPM1 único^C+programa de transcripción leucémica impulsado por [1, 8]. Por el contrario, los TAD disminuidos incluyeron inhibidores de la cinasa del ciclo celular (CDKI), como cdkn1a (p21) gen (Fig. 1G). Los TAD o sub-TAD alterados se definieron mediante la unión de CTCF cuando los integramos con el conjunto de datos ChIP-seq de CTCF de ratón disponible públicamente (GSM918744), por lo que CTCF se unió a los límites TAD o sub-TAD alterados (Fig. 1D-G, puntas de flecha rojas). Como era de esperar, la accesibilidad de la cromatina en Hoxa/b y Pbx3 los loci aumentaron coordinadamente (Figs. S1B, 1H). A la luz de NPM1^C+ interactuando directamente con CTCF y uniéndose a sus objetivos de cromatina [2, 3, 5], NPM1^C+ y CTCF pueden coordinarse para remodelar NPM1^C+- TAD de genes de firma que dan como resultado una accesibilidad alterada de la cromatina y firmas de expresión de genes oncogénicos.

Figura 1 — **Fig. 1: *NPM1*^C+ KI altera TAD hematopoyético resultó en *NPM1*^C+ perfil de expresión génica de la firma.**

A continuación, transfectamos células OCI-AML3 con WT que cuida el vector NPM1 ADNc para restaurar NPM1 nuclear (NPM1^OE), o células OCI-AML3 tratadas con inhibidor de XPO50 (XPO1i) 1 nM, selinexor, durante 3 días para bloquear el NPM1^C+ exportación citoplasmática, y probar si la restauración de NPM1 nuclear se revirtió NPM1^C+–firma de expresión HOX asociada y formación de TAD. La tinción inmunofluorescente confirmó que XPO1i o NPM1^OE resultó en la localización nuclear de NPM1 y mejoró su colocalización con CTCF (Fig. 2A). Retención nuclear de NPM1 reducida MI C, MEIS1y HOX la expresión génica, mientras que el aumento de CDKI, CDKN1A y CDKN2A genes (Fig. 2B), consistente con el análisis GO transcriptómico (Fig. S2A, B).

Figura 2 — **Fig. 2: La retención nuclear de NPM1 mejoró la interacción de NPM1 y CTCF y altera la formación de TAD leucémico y la expresión génica.**

A continuación, llevamos a cabo experimentos Hi-C y RNA-seq en WT, tratados con XPO1i o NPM1^OE células OCI-AML3 e integró nuestros datos Hi-C con los perfiles CTCF ChIP-seq disponibles generados en células K562 (GSM1010820). NPM1^OE alteró 96 TAD definidos por los límites de CTCF. Entre ellos, 55 TAD se redujeron, mientras que 41 TAD se incrementaron en NPM1^OE (Higo. 2C). De manera similar, el tratamiento con XPO1i alteró 97 TAD definidos por CTCF (59 TAD disminuidos y 38 TAD aumentados, datos no mostrados). Integramos aún más los datos transcriptómicos con conjuntos de datos Hi-C de XPO1i tratados o NPM1^OE Células OCI-AML3. Al NPM1^OE, el 24% de los genes que residen dentro de los TAD regulados al alza estaban regulados transcripcionalmente al alza determinados por RNA-seq (Fig. 2D, arriba), y estaban predominantemente involucrados en el ciclo celular, la diferenciación celular, la apoptosis, el daño y la reparación del ADN y la regulación de la transcripción (Fig. S2C, izquierda). Solo el 2.4% de los genes que residen dentro de los TAD regulados al alza estaban regulados transcripcionalmente a la baja (Fig. S2D, Izquierda). Por otro lado, el 16% de los genes incluidos en TAD reducidos estaban significativamente regulados a la baja de acuerdo con sus niveles de expresión (Fig. 2D, abajo), y se enriquecieron en vías implicadas en HOX, vías en cáncer, señalización de PI3K-AKT, señalización de Wnt, regulación positiva de ERK1/ERK2, regulación transcripcional, ciclo celular y regulación positiva de la proliferación celular (Fig. S2C, bien). Solo el 4.5% de los genes que residen dentro de los TAD regulados a la baja estaban regulados transcripcionalmente al alza (Fig. S2D, Bien). El tratamiento con XPO1i revela TAD y cambios transcriptómicos muy similares (Fig. S2E, F). Así, NPM1^C+-la alteración TAD impulsada puede ser crítica para el NPM1^C+ expresión génica característica.

En particular, los datos de Hi-C revelaron que los diez TAD más regulados incluían genes que codifican CDKI, p21, p15, p16y p27, mientras que los diez TAD reducidos principales incluyeron HOXB tanto en XPO1i como en NPM1^OE (Higo. 2E-G). Estos TAD o sub-TAD alterados se definen mediante la unión de CTCF cuando integramos con los datos CTCF ChIP-seq de las células K562 (GSM1010820), por lo que CTCF se une a los límites de los TAD o sub-TAD alterados (Fig. 2E-G; Puntas de flecha rojas). Curiosamente, los genes CDKI están regulados por el eje de transcripción MYC-MIZ-1 que está involucrado en el control de la proliferación de LSC y la progresión del ciclo celular.9].

Para respaldar aún más que la relocalización nuclear de NPM1 induce en parte la reorganización TAD del genoma, realizamos experimentos en el curso del tiempo con células OCI-AML3 tratadas con XPO1i durante 0, 1, 3, 6, 24 y 48 h. Observamos un aumento significativo en la localización nuclear de NPM1^C+ después de 24 h de tratamiento por WB (Fig. S3A) y tinción inmunofluorescente (Fig. S3B, C). El ensayo 3C del curso del tiempo reveló que los bucles CTCF abarcaban genes HOXB anteriores (HOXB1–HOXB5) se deterioraron significativamente tan pronto como 3 horas después de bloquear NPM1^C+ localización citoplasmática, mientras que las interacciones en bucle mediadas por CTCF abarcan CEBPA/G los genes aumentaron inmediatamente después del bloqueo de NPM1^C+ translocación citoplasmática (Fig. S3D, Mesa S2 enumeró todos los cebadores/sondas). Coordinadamente, los niveles de expresión de CDKI y CEBPA los genes solo se regularon al alza después de 24 horas y 3 días de tratamiento con XPO1i, respectivamente (Fig. S3E), lo que sugiere que la reorganización de TAD precede a los cambios en la expresión génica.

Se ha propuesto que MIZ-1 activa sus genes diana, incluidos CDKN1A y CDKN2B al asociarse con NPM1 y p300, mientras que en las células cancerosas transformadas con MYC, la asociación de MYC y MIZ-1 repele a NPM1 y p300, lo que conduce a una proliferación aberrante.10, 11]. Además, probamos si la restauración de NPM1 nuclear cambia el circuito de transcripción de MIZ-1 de la represión a la activación de CDKI al disociarse de MYC a favor de la interacción con NPM1. Aunque el nivel de MIZ-1 se mantiene relativamente constante con el tratamiento con XPO1i o NPM1^OE, estas intervenciones promovieron la interacción de MIZ-1 con NPM1 en el núcleo en comparación con las células OCI-AML3 no tratadas (Fig. S4A, abajo). Como consecuencia, la cantidad de p1 asociada a MIZ-300 aumentó, mientras que la unión de MIZ-1 a MYC y G9a, una H3K9-metiltransferasa asociada a MYC requerida para la represión, disminuyó notablemente tras la retención nuclear de NPM1 (Fig. S4A). RT-qPCR y RNA-seq revelaron que la expresión de varios objetivos MIZ-1, CDKI y CEBP genes, se incrementó significativamente (Fig. 2B, S3E, S4B). ChIP-qPCR reveló además que el reclutamiento de MYC y G9a en estos loci se redujo significativamente en comparación con la unión constante de cromatina MIZ-1 (Fig. S4C–E), mientras que el reclutamiento de NPM1 y p300 aumentó significativamente con el tratamiento con XPO1i o NPM1^OE (Higo. S4F, G). Como consecuencia, se incrementaron las marcas de cromatina activa H3K27ac (Fig. S4H) mientras que las marcas represivas de cromatina H3K9me2 se redujeron significativamente en estos genes diana MIZ-1 (Fig. S4I) en comparación con el control IgG (Fig. S4J), Sin embargo, no podemos distinguir si WT-NPM1 o NPM1^C+ regula CDKI y CEBP genes tras la retención nuclear de NPM1 porque el anticuerpo utilizado reconoció ambas formas.

Aunque el anticuerpo NPM1 que usamos no puede distinguir WT de la proteína mutante y su papel en la regulación de genes CDKI y CEBP, analizando los datos de Bru-seq de células OCI-AML1 tratadas con WT y XPO3i de datos publicados recientemente [2] también reveló que las transcripciones nacientes de CDKN1A y CEBPA Los genes se mejoran constantemente con el tratamiento con XPO1i (Fig. S4K), lo que respalda que la restauración nuclear de NPM1 invierte la topología TAD aberrante y cambia el eje MYC-MIZ-1 para restaurar el control del ciclo celular y la diferenciación mieloide. Sin embargo, queda por determinar cómo NPM1^c+/NPM1 se dirigieron a distintos sitios de cromatina para activar diferencialmente la vía de diferenciación oncogénica frente a mieloide. Dado que NPM1 interactúa con MIZ-1 y la cromatina unida a CRM1/XPO1 recluta a NPM1^C+ sobre HOX grupo [2, 3, 10, 12]. Es razonable sospechar que MIZ-1 o CRM1/XPO1 dirige NPM1 o NPM1^C+ a los objetivos de cromatina previstos, respectivamente. Además, los lncRNA asociados con HOX, BUEN DATO y HOXBLINC, se activan de forma aberrante en NPM1^C+-Células AML que también pueden desempeñar un papel en NPM1^C+expresión del gen oncogénico HOX impulsada por [8, 13, 14].

De acuerdo con la regulación positiva de CDKI junto con TF mieloides, CEBPA y CEBPD, la retención nuclear de NPM1 promovió la diferenciación de células OCI-AML3 observada por una mayor expresión de marcadores de superficie específicos de mieloides CD11b y CD14 (Fig. S5A–C). Además, la retención nuclear de NPM1 aumentó constantemente la proporción de células en la fase G1 a expensas de las células en la fase S y la transición de fase G2/M (Fig. S5D), que coincidió con un aumento de la apoptosis (Fig. S5E) y disminución de la proliferación celular (Fig. S5F). Es de destacar que XPO1i afecta el crecimiento y la diferenciación de las células OCI-AML3 de una manera independiente de p53 [15]. Probamos además si NPM1 restaurado en núcleos de NPM1^C+ Las células de AML afectan la leucemogénesis y la supervivencia de modelos de ratones con AML in vivo, trasplantamos 1 × 10⁶ peso, NPM1^OE Células OCI-AML3 en ratones NSG. Todos los animales trasplantados con células WT OCI-AML3 murieron alrededor de 38 días después del trasplante, mientras que los ratones que recibieron células OCI-AML3 con NPM1^OE sobrevivió entre 54 y 58 días (Fig. 2H). Por lo tanto, la localización nuclear de NPM1 mitiga la leucemogénesis en un modelo de ratón con xenoinjerto de AML con NPM1^C+, tal vez bloqueando NPM1^C+-dirigida por la topología TAD y la expresión génica característica y la restauración del control del ciclo celular y la diferenciación mieloide.

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Fuente: https://www.nature.com/articles/s41375-023-01942-9

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