Materiales

Amino polietilenglicol-bloque-poli(ácido láctico-co-glicólico) (NH₂-CLAVIJA-b-PLGA), polietilenglicol-bloque-poli(ácido láctico-co-glicólico) (PEG-b-PLGA), carboxilo poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA-COOH) y ciclo(-RGDfC) (denominado RGD) se adquirieron de Guangzhou Tansh-Tech Ltd., China. SPION se adquirió de Nanoeast, China.

Preparación de SPHN

Para la preparación de SPHN, se encapsuló SPION en el núcleo de PLGA hidrofóbico, seguido de la coordinación de CDDP con grupos carboxilo en la superficie del núcleo de PLGA y la conjugación de RGD en la cubierta de PEG. Brevemente, NH₂-CLAVIJA-b-PLGA (0.5 mg, 1 eq), PEG-b-PLGA (2 mg, 4 eq), PLGA-COOH (2.5 mg) y SPION (2 mg) se dispersaron en 2 ml de tetrahidrofurano (THF). Luego, la solución se agregó a 20 ml de solución tampón de fosfato (PBS, 1 mg/ml) con agitación vigorosa, seguido de agitación durante la noche a 35 °C para eliminar el THF. Luego, se añadió CDDP (2 mg) y la solución mixta se agitó en la oscuridad a 60 °C durante 12 h. RGD estaba vinculado a PEG de acuerdo con nuestro trabajo anterior de preparación de SPHN⁸. Luego, la solución de SPHN se dializó frente a PBS durante 48 h. Para la preparación de nanopartículas marcadas con fluorescencia, se empleó Cy5-NHS para marcar las nanopartículas antes de la conjugación con RGD. Brevemente, NH₂-CLAVIJA-b-PLGA (0.5 mg, 1 eq), PEG-b-PLGA (2 mg, 4 eq), PLGA-COOH (2.5 mg) y SPION (2 mg) se dispersaron en 2 ml de tetrahidrofurano (THF). Luego, la solución se agregó a 20 ml de solución tampón de fosfato (PBS, 1 mg/ml) con agitación vigorosa, seguido de agitación durante la noche a 35 °C para eliminar el THF. Se añadió CDDP (2 mg) y la solución mixta se agitó en la oscuridad a 60 °C durante 12 h. Luego, se añadieron 100 µL de solución de Cy5-NHS (100 µg/mL) disueltos en DMSO y se hizo reaccionar a 37 °C durante 2 h. Finalmente, RGD se unió a PEG de acuerdo con nuestro trabajo anterior para preparar SPHN⁸. La solución resultante se dializó en solución de PBS durante 48 h.

Caracterización fisicoquímica de SPHN

La dispersión de luz dinámica (DLS) y el potencial zeta se registraron usando un granulómetro Malvern. Las muestras de microscopía electrónica de transmisión (TEM) se prepararon utilizando una solución de SPHN (aproximadamente 0.05 mg/mL), y luego se observó la morfología del SPHN a través de TEM. Las eficiencias de carga de SPION y CDDP se registraron mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP‒MS).

Evaluación de la estabilidad in vitro

La estabilidad de SPHN (0.5 mg/ml) se evaluó en PBS y la dispersabilidad durante 12 h se registró con una cámara. Luego, la solución de SPHN se diluyó con PBS y el diámetro de SPHN se registró mediante DLS (0, 6 y 12 h).

liberación de drogas

La liberación de CDDP de SPHN fue determinada por ICP‒MS. Brevemente, se dializó 1 ml de SPHN frente a 9 ml de PBS a pH 7.4, 6.5 y 5.0. Luego, se recolectó 1 mL de dializado a la hora establecida para el análisis ICP‒MS.

Detección de especies reactivas de oxígeno (ROS) in vitro

Células de carcinoma nasofaríngeo humano (células CNE-1) se sembraron en placas confocales y se trataron con PBS, NPs/CDDP (10 µg CDDP/mL), NPs/SPION (100 µg Fe₃O₄/mL) y SPHN (10 µg CDDP/mL, 100 µg Fe₃O₄/mL). Veinticuatro horas más tarde, las células se trataron con rayos X (3 Gy) y luego se analizó el nivel de ROS en las células cancerosas. vía un kit de ensayo de especies reactivas de oxígeno y observado mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM).

Ensayo de formación de colonias

Las células CNE-1 en placas de 6 pocillos se trataron con SPHN (5 µg CDDP/mL) durante 24 h y se expusieron a irradiación de rayos X (3 Gy). Después de 7 días adicionales de incubación, las colonias se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 15 min. Luego, las colonias se tiñeron con cristal violeta al 0.1 % y se registraron utilizando un lector de placas AID vSpot Spectrum.

Análisis de apoptosis celular

Las células CNE-1 en placas de cultivo de 6 pocillos se trataron con PBS, rayos X (3 Gy), SPHN (10 µg CDDP/mL) y SPHN (10 µg CDDP/mL) + rayos X (3 Gy). Después de una incubación adicional de 24 h, se recolectaron todas las células, se lavaron con PBS tres veces, se tiñeron con un kit de apoptosis de Anexina V-FITC/PI y luego se registraron. vía citometría de flujo (FCM).

Efecto antitumoral combinado in vitro

Se evaluó el efecto del tratamiento in vitro de SPHN en células CNE-1 vía Kits de recuento de células-8 (CCK-8). Las células CNE-1 sembradas en placas de 96 pocillos se trataron con SPHN durante 12 h con diferentes concentraciones de CDDP (0-50 μg/mL) y se irradiaron con rayos X (3 Gy). Después de una incubación adicional de 12 horas, se administró CCK-1 al 5 % a las células CNE-8 durante 2 horas. Luego, se controló el efecto del tratamiento utilizando un lector de microplacas.

Evaluación de daños en el ADN

Las células CNE-1 sembradas en placas confocales se trataron con SPHN (10 µg de CDDP/mL) durante 24 h y luego se irradiaron con rayos X (3 Gy). Doce horas más tarde, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 15 min, se trataron con Triton X-0.1 al 100 % durante 20 min, se trataron con BSA al 1 % durante 1 h y se tiñeron con el anticuerpo γH2AX (Alexa Fluor® 488 Mouse anti- H2AX (pS319)) a 4 °C durante la noche. Finalmente, las células se lavaron con PBS tres veces, se tiñeron con DAPI y luego se tomaron imágenes usando CLSM.

Western blotting

Las células CNE-1 sembradas en placas de cultivo de 6 pocillos se trataron con PBS, rayos X, SPHN y SPHN + rayos X a una dosis de CDDP de 10 µg/mL y una dosis de radiación de 3 Gy y se incubaron durante 24 h, se lavaron con PBS tres veces, se lisaron con solución tampón RIPA que contenía inhibidores de fosfatasa y proteasa durante 0.5 h y se centrifugaron a 12,000 rpm a 4 °C durante 0.5 h. Se recogieron las proteínas y se cuantificaron sus concentraciones mediante un ensayo de proteínas BCA. Los lisados ​​celulares se separaron mediante SDS‒PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF y se probaron con anticuerpos primarios. Luego, las membranas se probaron con anticuerpos secundarios contra H₂HACHA, γH₂AX y β-actina e imágenes después de reactivos de quimioluminiscencia mejorada (ECL).

Secuenciación del transcriptoma (RNA-Seq)

Las células CNE-1, sembradas en placas de cultivo de 6 pocillos, se trataron con PBS, SPHN, rayos X y SPHN + rayos X a una dosis de CDDP de 10 µg/mL y una dosis de radiación de 3 Gy. Después de 24 h de irradiación con rayos X, las células se recolectaron, se agregaron a 1 ml de TRIzol y se enviaron a Ige Biotechnology, Ltd. (Guangzhou, China), para la extracción y secuenciación de ARN. Se utilizó un sistema Illumina NovaSeq 6000 para RNA-seq. Se utilizaron fragmentos por kilobase por millón de fragmentos mapeados (FPKM) para el análisis del nivel de expresión génica.

Efecto de orientación in vivo

El rendimiento de la orientación dual in vivo de SPHN se evaluó en ratones portadores de tumores CNE-1. Los grupos 1 y 2 fueron tratados con SPHN y no RGD marcados con Cy5, respectivamente. Al grupo 3 se le inyectó SPHN marcado con Cy5 y luego se trató con un campo magnético durante 1 hora. La formación de imágenes in vivo se realizó en un sistema de formación de imágenes FX in vivo Kodak IS 12 h después de la administración. Luego, todos los ratones fueron sacrificados para recolectar los principales órganos y tumores para obtener imágenes ex vivo. Finalmente, los tumores se recogieron para preparar secciones de parafina de 12 μm de espesor, se tiñeron con azul de Prusia y se observaron al microscopio óptico.

Efecto de la quimiorradioterapia in vivo

Se inocularon ratones desnudos BALB/c (4-5 semanas) con células CNE-1. Diez días después, los ratones fueron tratados con PBS, CDDP + rayos X, SPHN, SPHN + rayos X, SPHN + campo magnético (indicado como SPHN(M)) y SPHN(M) + rayos X el día 1, Día 3 y Día 5 a una dosis de CDDP de 2 mg/kg. Los días 2, 4 y 6, los grupos CDDP + rayos X, SPHN + rayos X y SPHN(M) + rayos X se trataron con rayos X a una dosis de irradiación de 3 Gy. El tamaño del tumor y el peso corporal se registraron durante 21 días.

Tinción inmunohistoquímica

Los tumores se recogieron y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 48 h. Luego, se prepararon secciones de parafina de 4 μm de espesor para la tinción con HE y se observaron las morfologías celulares de los tejidos tumorales. vía un microscopio óptico (Leica DMI6000 B). Con un método similar, se realizó la tinción con HE de los órganos principales de los grupos tratados con SPHN(M) + rayos X. Se prepararon secciones congeladas de ocho micrómetros de espesor para tinción con TUNEL y γ-H2AX. Después de teñir con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, fluorescencia azul), las células se observaron usando CLSM.

Pruebas bioquímicas de sangre

Se recogieron muestras de sangre de ratones tratados con PBS o SPHN en tubos Eppendorf heparinizados. Los indicadores clave, que incluyen alanina transaminasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), albúmina (ALB), bilirrubina total (TBIL), nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina (Crea), se detectaron utilizando un analizador bioquímico totalmente automático (Chemray 800, China).

Imágenes de resonancia magnética (RM) in vivo

Se escanearon ratones desnudos con tumor CNE-1 usando un escáner MR (Fov: 45 × 45, grosor: 1 mm, matriz: 224 × 221, cortes: 12, TE: 600 ms, TR: 1200, vóxel: 0.2 × 0.203 ). Con el mismo método, la adquisición de señales de RM generadas por SPHN en la región tumoral se realizó después de tratamientos con SPHN (50 µL, 10 µg SPION/mL).

• Distribución de relaciones públicas y contenido potenciado por SEO. Consiga amplificado hoy.
• EVM Finanzas. Interfaz unificada para finanzas descentralizadas. Accede Aquí.
• Grupo de medios cuánticos. IR/PR amplificado. Accede Aquí.
• PlatoAiStream. Inteligencia de datos Web3. Conocimiento amplificado. Accede Aquí.
• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41427-023-00484-x