Preparación y caracterización de materiales.

La solución acuosa de GO se diluyó en agua desionizada para obtener 0.15 mg  ml.^-1 La solución y se filtró al vacío a través de una membrana de nitrocelulosa con poros de 0.025 μm, formando una fina película de GO. Luego, la película delgada se transfirió al sustrato objetivo mediante transferencia húmeda en agua desionizada y recocido térmico adicional a 100 °C durante 2 min. La pila de película-sustrato de GO se redujo hidrotermalmente a 134 °C en un autoclave estándar durante 3 h para formar EGNITE. El sustrato base para todos los estudios de caracterización de EGNITE fue un cuadrado (1 × 1 cm²) de Si/SiO₂ (400 µm/1 µm).

XPS

Las mediciones de XPS se realizaron con un analizador Phoibos 150 (SPECS) en condiciones de vacío ultraalto (presión base, 5 × 10^-10 mbar) con una fuente de rayos X monocromática Al Kα (1,486.74 eV). Los espectros generales se adquirieron con una energía de paso de 50  eV y un tamaño de paso de 1  eV y los espectros de alta resolución se adquirieron con una energía de paso de 20  eV y un tamaño de paso de 0.05  eV. La resolución general en esas últimas condiciones es 0.58 eV, según se determina midiendo el ancho total en la mitad del máximo del Ag 3d5/2 pico de plata pulverizada. El análisis XPS muestra una fuerte disminución después del tratamiento hidrotermal del pico C–O (asociado a grupos epóxido), pero una pequeña contribución de C–OH, C=O y C(O)OH debido a hidroxilos, carbonilos y carboxilos que permanecen después de la reducción. La deconvolución del O1s El pico confirma tal comportamiento. La principal aportación al C1s La señal después de la reducción hidrotermal, sin embargo, proviene de sp² orbitales C – C hibridados^34,57.

difracción de rayos X

Mediciones de difracción de rayos X (θ-2θ escaneo) se realizaron en un difractómetro de investigación de materiales (Malvern PANalytical). Este difractómetro tiene una orientación horizontal. ω-2θ goniómetro (320 mm de radio) en una geometría de cuatro círculos y trabajado con un tubo de rayos X cerámico con ánodo de Cu Kα (λ = 1.540598 Å). El detector utilizado es un Pixcel que es un detector rápido de rayos X basado en la tecnología Medipix2.

Espectroscopia raman

Las mediciones de espectroscopía Raman se realizaron utilizando un espectrógrafo Witec equipado con una línea de excitación láser de 488 nm. Para las mediciones, los espectros Raman se adquirieron utilizando un objetivo de 50 × y una rejilla de 600 ranuras por nm; La potencia del láser se mantuvo por debajo de 1.5 mW para evitar el calentamiento de la muestra.

TEM

Se preparó una laminilla de haz de iones enfocado con un Helios NanoLab DualBeam (LMA-INA) para el estudio transversal de la muestra EGNITE. Los análisis estructurales se realizaron mediante TEM utilizando un microscopio Tecnai F20 operado a 200 kV, incluidas técnicas HRTEM y STEM de campo oscuro anular de alto ángulo. El experimento STEM-EELS se realizó en un microscopio Tecnai F20 trabajando a 200 KeV, con una apertura de 5 mm, una longitud de cámara de 30 mm, un ángulo de convergencia de 12.7 mrad y un ángulo de recolección de 87.6 mrad. Como utilizamos 0.5 eV por píxel y 250 eV como energía inicial en la adquisición de pérdida de núcleo, no adquirimos el borde K de Si esperado en 1,839 eV, el borde M de Pt en 2,122 eV y el borde M de Au en 2,206 eV. La composición atómica relativa de C – O se obtuvo centrando nuestra atención en la capa GO reducida y asumiendo que los bordes analizados (C y O en nuestro caso) suman 100%. Esta suposición es válida en nuestro caso como se evidencia en el Información suplementaria mapas. La sección transversal del diferencial de energía se calculó utilizando el modelo Hartree-Slater y el fondo utilizando un modelo de baja potencia.

Conductividad eléctrica

Las mediciones de conductividad eléctrica se realizaron utilizando un medidor de fuente Keithley 2400 en configuración de dos puntos. Las muestras medidas consistieron en películas EGNITE de 1 × 1 cm.² encima de un SiO₂ sustrato

El análisis de datos

Los datos de difracción de rayos X, Raman y XPS se analizaron utilizando paquetes Python 3.7 (Numpy, Pandas, Scipy, Xrdtools, Lmfit, Rampy, Peakutils, Matplotlib). La distancia entre planos se calculó a partir de mediciones de difracción de rayos X según la ley de Snell. Una vez que los datos se trasladaron al dominio espacial, se ajustó el máximo de los picos. La distancia correspondiente dio un valor medio de la distancia entre planos. Las desviaciones de esos valores medios se calcularon a partir del ancho total a la mitad del máximo de los ajustes de Lorentz de los picos en el dominio espacial. Las mediciones de espectroscopía XPS y Raman se analizaron ajustando una convolución de picos en las ubicaciones esperadas para las características correspondientes. Los valores de conductividad de GO y EGNITE se obtuvieron ajustando el I–V curvas medidas en las mediciones de conductividad eléctrica según la ley de Ohm. Los datos son n = 1 para cada medición.

Fabricación de matrices flexibles

La fabricación de los dispositivos se muestra en la figura complementaria. 4. Los dispositivos se fabricaron en Si/SiO de 4 pulgadas.₂ (400 μm/1 μm) obleas. Primero, se recubrió por rotación una capa de PI de 10 µm de espesor (PI-2611, HD MicroSystems) sobre la oblea y se horneó en una atmósfera rica en nitrógeno a 350 °C durante 30 min. Se modelaron rastros metálicos utilizando litografía óptica del fotoprotector de inversión de imagen (AZ5214, Microchemicals). Se utilizó evaporación por haz de electrones para depositar 20 nm de titanio y 200 nm de oro y se realizó el despegue. Utilizamos una película EGNITE de aproximadamente 1 μm de espesor como compensación entre el rendimiento electroquímico y la flexibilidad de la matriz. Después de transferir la película GO, el aluminio se evaporó con haz electrónico y las áreas en la parte superior de los futuros microelectrodos se definieron utilizando un fotoprotector negativo (nLOF 2070, Microchemicals) y se despegaron. A continuación, la película GO se grabó en todas partes, excepto en los futuros microelectrodos, utilizando un grabado con iones reactivos de oxígeno (RIE) durante 5 min a 500 W y las columnas protectoras de aluminio se grabaron con una solución diluida de ácidos fosfórico y nítrico. Luego, se depositó una capa de PI-3 de 2611 µm de espesor sobre la oblea y se horneó como se describió anteriormente. Luego se definieron las aberturas PI-2611 en el microelectrodo utilizando un fotoprotector grueso positivo (AZ9260, Microchemicals) que actuó como una máscara para un RIE de oxígeno posterior. Posteriormente, los dispositivos se modelaron en la capa PI, nuevamente usando fotorresistente AZ9260 y RIE. Luego se eliminó la capa fotorresistente en acetona y la oblea se limpió en alcohol isopropílico y se secó. Finalmente, los dispositivos se despegaron de la oblea y quedaron listos para ser colocados en bolsas de esterilización para ser tratados hidrotermalmente a 134 °C en un autoclave estándar durante 3 h.

Caracterización electroquímica de microelectrodos.

La caracterización electroquímica de los microelectrodos se realizó con un potenciostato Metrohm Autolab PGSTAT128N en 1 × PBS (Sigma-Aldrich, P4417) que contenía tampón fosfato 10 mM, NaCl 137 mM y KCl 2.7 mM a pH 7.4 y utilizando una configuración de tres electrodos. Se utilizó como referencia un electrodo de Ag/AgCl (FlexRef, WPI) y como contraelectrodo un alambre de platino (Alfa Aesar, 45093).

Antes de la evaluación del rendimiento, los electrodos recibieron 10,000 pulsos de carga equilibrada (1 ms, 15 μA). La exposición de los electrodos a protocolos de pulsación continua se realizó mediante 100 ciclos de voltamperometría cíclica (−0.9 a +0.8 V) a 50 mV s.^-1, 20 repeticiones de 5,000 pulsos (1 ms) y redeterminación del potencial de circuito abierto.

El análisis de datos

Los datos de caracterización electroquímica se analizaron utilizando paquetes Python 3.7 (Numpy, Pandas, Scipy, Pyeis, Lmfit, Matplotlib). Los datos de espectroscopía de impedancia se ajustaron a un modelo eléctrico equivalente que consta de una resistencia (R) en serie con un elemento de fase constante (CPE). A partir de ahí, el valor de CPE se aproximó a una capacitancia y se dividió por el área geométrica del microelectrodo para obtener un valor equivalente para la capacitancia interfacial de EGNITE. La capacitancia de almacenamiento de carga del microelectrodo (CSC) se calculó a partir de mediciones de voltamperometría cíclica integrando los regímenes catódico y anódico de la corriente medida y normalizando mediante la velocidad de exploración. La capacitancia de almacenamiento de carga catódica y anódica (cCSC y aCSC) a una velocidad de escaneo de 100 mV de EGNITE es 45.9 ± 2.4 y 34.6 ± 2.8 mC cm.^-2respectivamenten = 3). Como se informó para otros materiales.⁵⁸, las CSC obtenidas dependen de la velocidad de exploración (Fig. 5). Para evaluar la presencia de reacciones de reducción de oxígeno, medimos la forma de onda CV bajo electrolito purgado con nitrógeno.⁵⁹ y no observó diferencias sustanciales en la forma de onda (Fig. 6). Sin embargo, nuestros resultados no abordan completamente el impacto de las reacciones de reducción de oxígeno en la capacidad de inyección de carga de EGNITE y es necesario realizar trabajo adicional para investigar esto adecuadamente. La capacidad de inyección de carga del microelectrodo (CIC) se estableció determinando la amplitud del pulso de corriente que provocó una diferencia de voltaje (después de eliminar la caída óhmica) que coincidía con la ventana de agua electroquímica del electrodo (−0.9 V para catódico y +0.8 V para anódico frente a Ag/AgCl). ) (Figura complementaria. 17)⁶⁰.

análisis estadístico

Los datos son medias ± sd, n = 18 para EIS y n = 3 para cronopotenciometrías. Los datos del mapa de excursión de voltaje capacitivo catódico son la media de las excursiones de voltaje capacitivo catódico para un evento para cada forma de pulso de n = 3 electrodos.

Evaluación de estabilidad mecánica.

Sonicación por ultrasonido

Los conjuntos de electrodos EGNITE se colocaron dentro de un vaso de precipitados lleno de agua en un baño de agua con ultrasonidos (Elmasonic P 180H). Se aplicó sonicación a 37 kHz durante 15 min a 200 W, seguido de 15 min adicionales de sonicación a 37 kHz con la potencia elevada a 300 W. Se adquirieron imágenes de los electrodos antes y después de los pasos de sonicación.

Test de doblado

La configuración de flexión (Fig. 2k) constaba de tres varillas cilíndricas; el del medio (diámetro, 700 µm) se bajó, produciendo ángulos de flexión de 131°. Para la prueba de flexión se utilizaron tres conjuntos de microelectrodos flexibles. Cada conjunto contenía 18 microelectrodos de 50 µm de diámetro. Se midieron dos conjuntos después de 10 y 20 ciclos, mientras que un dispositivo se midió solo durante 10 ciclos ya que se dañó durante la manipulación después de la medición. El ciclo de prueba de flexión consistió en una aplicación de carga de 10 s de duración más 10 s sin carga. Los dispositivos se caracterizaron electroquímicamente (EIS y CV) antes y después de 10 y 20 ciclos de flexión.

Registro neuronal epicortical

Implantación epicortical

Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del Consejo de la Comunidad Europea y la legislación francesa para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Los protocolos fueron aprobados por el comité ético de Grenoble (ComEth) y autorizados por el ministerio francés (número 04815.02). Ratas Sprague-Dawley (machos, 4 meses de edad, con un peso ~600 g) se anestesiaron por vía intramuscular con ketamina (50 mg por kg (peso corporal)) y xilazina (10 mg por kg (peso corporal)), y luego se fijaron a un soporte estereotáxico. La extracción del cráneo temporal expuso la corteza auditiva. Se conservó la duramadre para evitar dañar el tejido cortical. Se perforó un orificio en el vértice para insertar el electrodo de referencia, y un segundo orificio, a 7 mm hacia el frente del primero, para insertar el electrodo de tierra. Los electrodos eran clavijas de 0.5 mm de espesor utilizadas para enchufes de circuitos integrados. Se colocaron para hacer contacto eléctrico con la duramadre y se fijaron al cráneo con cemento dental. Luego montamos la cinta de microelectrodos de superficie en la corteza auditiva como se muestra en la Fig. 3b. Los patrones venosos identifican la corteza auditiva, en el área 41 del mapa cerebral de rata de Krieg. Las señales corticales se amplificaron simultáneamente con una ganancia de 1,000 y se digitalizaron a una frecuencia de muestreo de 33 kHz. Un altavoz situado a 20 cm delante de la oreja de una rata, contralateral a la corteza expuesta, emitía estímulos acústicos. Los estímulos entregados fueron monitoreados por un micrófono de 0.25 pulgadas (Brüel & Kjaer, 4939) colocado cerca del oído y presentado en nivel de presión sonora (dB SPL re 20 μPa). Examinamos las respuestas de latencia media de vértice positivo (negativo-arriba) evocadas por clics alternos a 80 dB SPL y estímulos de ráfaga de tono a 70 dB SPL con frecuencias que van de 5 a 40 kHz, un tiempo de subida y bajada de 5 ms y una duración de 200 ms.

El análisis de datos

Los datos electrofisiológicos se analizaron utilizando paquetes Python 3.7 (Numpy, Pandas, Scipy, Neo, Elephant, Sklearn Matplotlib) y la biblioteca personalizada PhyREC (https://github.com/aguimera/PhyREC). r.m.s. Los valores se calcularon con una ventana deslizante de 20 ms en frecuencias superiores a 200 Hz. Los espectrogramas se calcularon para un rango entre 70 Hz y 1.1 kHz. La PSD se calculó sobre 60 segundos de grabaciones continuas. Para una matriz de electrodos determinada, se calcularon dos PSD: in vivo (IV) y post-mortem (PM). La SNR se expresa en dB (20 × ln(r.m.s.(IV)/r.m.s.(PM))) y se interpola para 20 puntos espaciados logarítmicamente entre 10 Hz y 1 kHz.

análisis estadístico

Los datos neuronales epicorticales presentados en la Fig. 3 se toman a partir de mediciones individuales en un solo animal. En la Fig. 3c, se presentan datos de 64 electrodos. En la Fig. 3d, se presentan datos de dos electrodos seleccionados. En la Fig. 3f, la PSD y la SNR se calculan a partir de 64 electrodos EGNITE y se muestran como media ± ± sd. En la figura complementaria. 12c, d Los datos medianos se presentan para 192 electrodos EGNITE de n = 3 experimentos y 60 electrodos de platino de n = 1 experimento.

Registro neuronal intracortical

Implantación intracortical

Los animales fueron anestesiados con una mezcla de ketamina/xilazina (75:1, 0.35 ml/28 g ip) y este estado se mantuvo con una máscara de inhalación que proporcionaba 1.5% de isoflurano. Se colocaron varios microtornillos en el cráneo para estabilizar el implante y el que está en la parte superior del cerebelo se utilizó como base general. La sonda se implantó en la corteza prefrontal (coordenadas: AP, 1.5 mm; ML, ±0.5 mm; DV, −1.7 mm desde bregma). La implantación se realizó recubriendo la sonda con maltosa (consulte el protocolo a continuación) para proporcionar rigidez temporal a la sonda y facilitar la inserción de la sonda. La sonda se selló con cemento dental. Se utilizaron conectores TDT-ZifClip para conectar la sonda al sistema electrofisiológico mediante un cable miniaturizado. Después de la cirugía, el ratón pasó por un período de recuperación de 1 semana recibiendo tratamientos de analgesia (buprenorfina) y antiinflamatorios (meloxicam). La actividad neuronal se registró con el sistema multicanal Open Ephys a una frecuencia de muestreo de 30 kHz con un amplificador Intan RHD2132. Los experimentos de tareas auditivas se llevaron a cabo en una caja insonorizada, con dos parlantes en su interior, utilizando protocolos basados ​​en trabajos descritos anteriormente.⁶¹. El estímulo sonoro consistió en un clic de ruido blanco de 15 ms de duración, repetido 100 veces (ciclos), cada uno separado por 5 s (intervalo entre estímulos). Durante la tarea, el animal pudo moverse libremente.

Protocolo de refuerzo de maltosa

Se calienta una solución acuosa de maltosa hasta el punto de transición vítrea (T_g), entre 130 y 160 °C, utilizando una placa caliente o un microondas. Una vez que la maltosa es viscosa, la parte posterior de la sonda se pone en contacto sólo con la maltosa. A medida que la maltosa se enfría, endurece y endurece la sonda.

El análisis de datos

Las señales neuronales de cada electrodo se filtraron fuera de línea para extraer SUA y LFP. SUA se estimó filtrando la señal entre 450 y 6,000 Hz y los picos de neuronas individuales se clasificaron mediante análisis de componentes principales con Offline Sorter v.4 (Plexon). Para obtener LFP, las señales se redujeron a 1 kHz, se les quitó la tendencia y se les realizó un filtrado de muesca para eliminar los artefactos de la línea de ruido (50 Hz y sus armónicos) con scripts escritos a medida en Python. AEP SNR se calculó como la relación entre la amplitud máxima de N1 y la sd. de un período de 20 ms antes del estímulo.

análisis estadístico

Datos mostrados en la Fig. 3h,yo son medias ± sd, n = 30 como número de ensayos promediados. Los datos registrados con el mismo electrodo se muestran los días 30, 60 y 90. Se presentan datos de un solo animal.

Biocompatibilidad epicortical crónica

Implantación quirúrgica de dispositivos.

Para este estudio se utilizaron un total de 27 ratas Sprague-Dawley macho adultas (Charles River). Los animales se alojaron a una temperatura ambiente de 21 ± 2 °C y una humedad de 40–50%, en un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad. Las ratas se alojaron en grupos y se les dio libre acceso a dieta y agua durante todo el período experimental. Los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal (1998), bajo la aprobación del Ministerio del Interior del Reino Unido y el organismo local de revisión ética del bienestar animal (AWERB). Los animales se anestesiaron con isoflurano (2-3%) durante la cirugía y la profundidad de la anestesia se controló mediante la prueba del reflejo de pellizco del dedo del pie. Los animales se colocaron en un marco estereotáxico (Kopf, 900LS), ubicado encima de una manta térmica para mantener la temperatura corporal. Un agujero de craneotomía (~5 mm ×4 mm) se hizo a 1 mm de distancia de la línea media usando un taladro dental con una broca de 0.9 mm, se extrajo la duramadre y se colocó el dispositivo epicortical en la superficie cortical del cerebro. El orificio de la craneotomía se selló con Kwik-sil, seguido de cemento dental para asegurarlo y se suturó la piel. Se administraron inyecciones subcutáneas de solución salina (1 ml por kg (peso corporal)) y buprenorfina (0.03 mg por kg (peso corporal)) para reemplazar los líquidos perdidos y reducir el dolor posoperatorio, y se retiró la anestesia.

Recolección y procesamiento de tejidos.

Los animales se terminaron a las 2, 6 o 12 semanas después de la implantación mediante un método apropiado para el tipo de análisis a realizar.

Histología e inmunohistoquímica.

A las 2, 6 o 12 semanas después de la implantación, se interrumpió la perfusión cardíaca en ratas con heparinizado (10 U ml^-1, Sigma-Aldrich) PBS, seguido de paraformaldehído al 4% (PFA, Sigma-Aldrich) en PBS. Los cerebros se fijaron posteriormente en PFA al 4 % durante 24 h, luego se transfirieron a sacarosa al 30 % en PBS durante al menos 48 h antes de congelarlos en isopentano. Luego, los cerebros se almacenaron a -80  °C hasta que se crioseccionaron a 25   µm. Luego, el tejido se tiñó para detectar la molécula adaptadora de unión de calcio ionizado 1 (Iba-1) para determinar el nivel de activación microglial. Brevemente, las secciones de tejido se bloquearon con suero de cabra al 5 % en PBS con Triton-X al 0.1 % durante 1 hora antes de la incubación durante la noche a 4 °C con el anticuerpo primario anti-Iba-1 (1:1,000, 019-19741; Wako). Luego, las secciones se tiñeron con anticuerpo secundario, anti-conejo Alexa Fluor 594 (1:400, A-11012; Thermo Fisher) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los portaobjetos se montaron con cubreobjetos utilizando un medio de montaje antidesvanecimiento Prolong Gold con 4,6-diamidino-2-fenilindol (Thermo Fisher). La sonda cubrió un área de 3 × 3.7 mm² en la superficie cortical del cerebro; Las secciones de tejido seleccionadas para la tinción cubrieron 3.2 mm de longitud de esta región. Se tomaron imágenes de los portaobjetos utilizando un escáner de portaobjetos de microscopio 3DHistech Pannoramic-250 a 20 × y las imágenes se analizaron utilizando CaseViewer v.2.4 (3DHistech). Para evaluar la activación de la microglía, se cubrió un área de 3.2 mm y se analizó una imagen cada 100 µm. Se tomaron imágenes con un aumento de 8.5× que detallaban una sección del sitio de la sonda epicortical, a 3 mm de la línea media del cerebro, que abarca el área directamente debajo del sitio de la sonda.

Procesamiento de imágenes

Los datos de microscopía se procesaron mediante imágenes utilizando un algoritmo para la caracterización del fenotipo de microglia (Figura complementaria. 13). La activación microglial se analizó utilizando un CellProfiler* personalizado (Broad Institute, v.3.1.9 de https://cellprofiler.org/) tubería. En primer lugar, se utilizó el módulo EnhanceOrSuppressFeatures para mejorar estructuras filamentosas como neuritas mediante la aplicación del método de mejora de la tuberosidad. A partir de las imágenes mejoradas, las celdas se segmentaron utilizando el módulo IdentificarPrimaryObjects. Las mediciones preliminares de las celdas sugirieron que el rango apropiado de diámetro del objeto era de 3 a 40 píxeles. Se descartaron los objetos fuera de este rango de diámetro o que tocaran el borde de la imagen. Las células se segmentaron utilizando una estrategia de umbral adaptativo Otsu de dos clases con un tamaño de ventana adaptativa de 50 píxeles. Los objetos identificados por el módulo IdentityPrimaryObjects se ingresaron al módulo MeasureObjectSizeShape para calcular las propiedades necesarias para la clasificación de celdas. En el módulo ClassifyObjects, la categoría en la que basar las clasificaciones se especificó como AreaShape y se seleccionó Extensión como la medida correspondiente. Las células fueron clasificadas como "activado" o "no activado" según su propiedad Extensión, que es la relación entre el área ocupada por la celda y el área ocupada por su cuadro delimitador. Este enfoque de clasificación se racionalizó por el hecho de que la microglía activada tiene cuerpos celulares grandes y no tiene procesos y, por lo tanto, ocupa una proporción mucho mayor de sus cuadros delimitadores que sus contrapartes no activadas. Finalmente, se utilizaron los módulos CalculateMath y ExportToSpreadsheet para calcular y generar las estadísticas deseadas.

análisis estadístico

Los conjuntos de datos son n = 3 para cada tipo de dispositivo (implante solo PI (PI); PI con oro microfabricado expuesto (oro); y PI con oro microfabricado y EGNITE (EGNITE) en todos los momentos) con la excepción del oro de 6 semanas que es n = 2 para datos ELISA. Los hemisferios contralaterales se combinaron en cada momento para dar n = 9 a las 2 y 12 semanas postimplantación y n = 8 a las 6 semanas postimplantación. El análisis de los datos se realizó utilizando el software GraphPad Prism v.8. El análisis estadístico se completó mediante un análisis de varianza de dos factores (ANOVA) con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey cuando correspondía; P < 0.05 se consideró significativo.

ELISA

Después del período de implantación, los animales fueron eliminados mediante dislocación cervical. Se extrajo tejido cerebral del hemisferio derecho e izquierdo del cerebro, se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior. El tejido se lisó utilizando tampón de lisis NP-40 (NaCl 150 mM, Tris-Cl 50 mM, sustituto Nonidet P1 al 40 %, Fluka, pH ajustado a 7.4) que contenía proteasa e inhibidor de fosfatasa (Cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa Halt, Thermo Fisher). seguido de rotura mecánica del tejido (TissueLyser LT, Qiagen). Luego, las muestras se centrifugaron durante 10 min a 5,000 rpm y el sobrenadante se almacenó a 4 °C hasta su uso posterior. Se ejecutó el panel de inflamación de ratas LEGENDplex (número de catálogo 740401, BioLegend), un kit ELISA múltiplex basado en perlas, para cuantificar las siguientes citoquinas; IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-18, IL-33, CXCL1 (KC), CCL2 (MCP-1), estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos factor, interferón-γ y factor de necrosis tumoral. El kit se ejecutó según las instrucciones del fabricante, con proteína cargada en un volumen fijo de 15 µl. Después de la incubación con el sobrenadante, las perlas se procesaron en un citómetro de flujo BD FACSVerse y los datos se analizaron utilizando el software de análisis de datos LEGENDplex.

estimulación neuronal

implantación intrafascicular

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Ético de la Universitat Autònoma de Barcelona de acuerdo con la Directiva 2010/63/UE del Consejo de las Comunidades Europeas. Los animales se alojaron a 22 ± 2 °C bajo un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad con comida y agua disponibles libremente. El nervio ciático de ratas Sprague-Dawley hembra anestesiadas (250–300 g, ~18 semanas de edad) fue expuesta quirúrgicamente y los electrodos TIME se implantaron transversalmente a través del nervio ciático con la ayuda de una aguja recta unida a un hilo de bucle 10-0.⁴⁶. El proceso fue monitoreado bajo un microscopio de disección para asegurar la posición correcta de los sitios activos dentro de los fascículos nerviosos (Fig. 4b). Durante los experimentos, la temperatura corporal del animal se mantuvo con una almohadilla térmica.

La estimulación nerviosa se realizó aplicando trenes de pulsos de corriente bifásicos de una duración fija de 100 µs por fase y aumentando la amplitud de 0 a 150 µA en pasos de 1 o 3 µA a 3 Hz durante 33 s (Estimulador DS4, Digitimer) a través de los diferentes EGNITE. microelectrodos. Simultáneamente, se registraron los CMAP de los músculos GM, TA y PL utilizando pequeños electrodos de aguja (13 mm de largo, 0.4 mm de diámetro, electrodos de aguja de acero inoxidable A-03-14BEP, Bionic) colocados en cada músculo.⁶². El electrodo activo se colocó sobre el vientre muscular y la referencia a nivel del tendón. Las grabaciones de electromiografía se amplificaron (×100 para GM y TA, ×1,000 para PL; amplificadores P511AC, Grass), se filtraron paso de banda (3 Hz a 3 kHz) y se digitalizaron con un sistema de grabación PowerLab (PowerLab16SP, ADInstruments) a 20 kHz.

El análisis de datos

La amplitud de cada CMAP se midió desde el inicio hasta el pico negativo máximo. Las mediciones del pico de voltaje se normalizaron a la amplitud CMAP máxima obtenida para cada músculo en el experimento. Se calculó un índice de selectividad (SI) para cada sitio activo como la relación entre la amplitud CMAP normalizada para un músculo, CMAP_i, y la suma de las amplitudes CMAP normalizadas en los tres músculos, siguiendo la fórmula SI_i = nCMAP_i/∑nCMAP_j, en la amplitud mínima de la corriente de estimulación que provocó una respuesta muscular mínima funcionalmente relevante (definida como al menos un 5% de amplitud CMAP para uno de los músculos con respecto a la amplitud CMAP máxima de ese músculo que se había determinado previamente). Luego, los sitios activos con el SI más alto para cada uno de los tres músculos se seleccionaron como SI para cada músculo en un experimento determinado.

Biocompatibilidad intraneural crónica

Siguiendo un procedimiento previamente informado^50,63, el nervio ciático de ratas hembra Sprague-Dawley anestesiadas (250-300 g, ~18 semanas de edad) fue expuesto y los dispositivos para biocompatibilidad in vivo con y sin EGNITE fueron implantados longitudinalmente en la rama tibial del nervio ciático (n = 6–8 por grupo). Brevemente, se perfora el nervio en la trifurcación con una aguja recta unida a un hilo de bucle 10-0 (STC-6, Ethicon); el hilo tira de la punta en forma de flecha de la tira de electrodo doblada. Se corta la punta para quitar el hilo, y se doblan ligeramente las puntas de cada brazo para evitar que se salga el dispositivo. Se optó por un implante longitudinal porque permite un mejor estudio de la respuesta al cuerpo extraño en el interior del nervio.⁵⁰.

Evaluación funcional de nervios y animales.

Los animales fueron evaluados durante el seguimiento postimplantación mediante pruebas de conducción nerviosa, algesimetría y locomoción en huella.⁶². Para las pruebas de conducción, se estimuló el nervio ciático de las patas implantadas y contralaterales mediante electrodos de aguja en la muesca ciática y se registró el CMAP del músculo PL como se indicó anteriormente. Se midieron la latencia y la amplitud del CMAP. Para la prueba de algesimetría, las ratas se colocaron sobre una plataforma de red de alambre y se les aplicó un estímulo mecánico no nocivo con una punta de metal conectada a un algesímetro electrónico Von Frey (Bioseb). Se midió el umbral nociceptivo (fuerza en gramos con la que los animales retiraron la pata) de las patas implantadas frente a las contralaterales. Para la prueba de la pista de marcha, se pintó la superficie plantar de las patas traseras con tinta negra y se dejó que cada rata caminara por un pasillo. Se recogieron las huellas y se calculó el índice funcional ciático.⁶².

Histología

Después de 2 u 8 semanas, se perfundió a los animales con PFA (4%) y se extrajeron los nervios ciáticos, se fijaron posteriormente, se criopreservaron y se procesaron para análisis histológico. Para la evaluación de la FBR, se cortaron los nervios ciáticos en secciones transversales de 15 μm de espesor con un criostato (Leica CM190). Las muestras se tiñeron con anticuerpos primarios para axones mielinizados (anti-RT97 para marcar Neurofilamento 200K, 1:200; Developmental Studies Hybridoma Bank) y macrófagos (anti-Iba-1, 1:500; Wako). Luego, las secciones se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios de burro anti-ratón Alexa Fluor 488 y burro anti-conejo Alexa Fluor 555 (1:200, Invitrogen). Se seleccionaron secciones representativas de la parte central del implante en el nervio tibial, se tomaron imágenes con un microscopio de epifluorescencia (Eclipse Ni, Nikon) conectado a una cámara digital (DS-Ri2, Nikon) y se realizaron análisis de imágenes con el software ImageJ (National Institutes de salud). Se cuantificó la cantidad de células positivas para Iba-1 en toda el área del nervio tibial y se midió el grosor de la cápsula de tejido como la distancia media de cada lado del implante a los axones más cercanos.

análisis estadístico

Para el análisis estadístico de los datos, utilizamos ANOVA de una o dos vías seguido de la prueba post hoc de Bonferroni para las diferencias entre grupos o tiempos. Se utilizó el software GraphPad Prism para la representación y análisis gráfico. Se consideró significación estadística cuando P <0.05.

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de la cartera de naturaleza vinculado a este artículo.

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01570-5