Síntesis de nanobots

Los nanobots se prepararon como se describió anteriormente.³³. En resumen, los MSNP se sintetizaron utilizando un método de Stöber modificado.⁴¹, haciendo reaccionar trietanolamina (35 g), agua ultrapura (20 ml) y bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB; 570 mg) a 95 °C durante 30 min mientras se agita. Posteriormente se añadió gota a gota ortosilicato de tetraetilo (1.5 ml); la mezcla se dejó reaccionar durante 2 h a 95 °C y los MSNP resultantes se recogieron por centrifugación y se lavaron en etanol (tres veces, 2,500g, 5 minutos). Para eliminar la plantilla CTAB, los MSNP se colocaron a reflujo en metanol ácido (1.8 ml de HCl, 30 ml de metanol) durante 24 h. Luego, los MSNP se recogieron por centrifugación y se lavaron tres veces en etanol (2,500g, 5 min) antes de incorporar la modificación de amina agregando APTES (6 μl por mg de MSNP) a MSNP (1 mg ml^-1) en una solución etanólica al 70% a 70 °C, agitando vigorosamente durante 1 h. MSNP-NH₂ se recogieron y se lavaron tres veces en etanol y tres veces en agua por centrifugación (tres veces, 1,150g, 5 minutos). MSNP-NH₂ Se resuspendieron en PBS a una concentración de 1 mg ml.^-1 y volumen total de 900 μl, y se activó con glutaraldehído (100 μl) durante 2.5 h a temperatura ambiente. Los MSNP activados-NH₂ se recogieron y se lavaron en PBS tres veces mediante centrifugación (1,150g, 5 min), resuspendido en una solución de ureasa (3 mg ml^-1) y PEG heterobifuncional (1 μg de PEG por mg de HS-MSNPs-NH5 de XNUMX kDa₂) en PBS y se hizo reaccionar durante 24 h a temperatura ambiente. Los nanobots resultantes se recogieron y se lavaron tres veces en PBS mediante centrifugación (1,150g, 5 min) antes de resuspenderlos en una dispersión de AuNP, preparada como se describió anteriormente⁵¹, dejándolas reaccionar durante 10 min, y lavando minuciosamente por centrifugación (tres veces, 1,150g, 5 minutos).

Distribución de tamaño hidrodinámico y carga superficial de los MSNP, MSNP-NH₂, los nanobots y los nanobots decorados con AuNP se determinaron utilizando un sistema de dispersión de luz dinámica Wyatt Mobius y un Malvern Zetasizer, respectivamente. En todos los casos la concentración fue de 20 μg ml.^-1 y tiempo de adquisición 5 s, utilizando tres ejecuciones por experimento. Se realizaron tres mediciones por tipo de partícula.

Síntesis de FITC MSNP

Se preparó una mezcla de FITC (2 mg), etanol (5 ml) y APTES (400 µl) y se agitó durante 30 min. Luego, se siguió el protocolo descrito anteriormente para la síntesis de MSNP, excepto que agregamos ortosilicato de tetraetilo (1.25 ml) gota a gota en combinación con la mezcla FITC-APTES (250 μl). Los pasos de funcionalización para obtener nanobots marcados con FITC fueron los mencionados anteriormente.

Síntesis de AuNP

Las AuNP se sintetizaron utilizando un método informado.³³. En resumen, todos los materiales se limpiaron con agua regia recién preparada, se enjuagaron minuciosamente con agua y se secaron al aire. Posteriormente, un AuCl de 1 mM₄ La solución se calentó hasta su punto de ebullición mientras se agitaba en un matraz de fondo redondo integrado en un sistema de reflujo. Después de esto, se añadieron 10 ml de solución de citrato de sodio (30.8 mM) y la solución se hirvió durante 20 min, dando como resultado un color rojo. Luego se dejó enfriar la solución hasta temperatura ambiente mientras se agitaba durante 1 hora. Las AuNP resultantes se almacenaron en la oscuridad y la caracterización se realizó mediante microscopía electrónica de transmisión.

Actividad enzimatica

Actividad enzimática de nanobots, ¹⁸F-nanobots y ¹³¹Los I-nanobots se midieron utilizando rojo de fenol. Para ello, se utilizan 2 μl de nanobots (1 mg ml^-1) se añadieron a una placa de 96 pocillos y se mezclaron con 200 µl de diferentes soluciones de urea (0, 50, 100, 200 mM) en rojo de fenol 1.1 mM. Se midió la absorbancia a 560 nm a lo largo del tiempo a 37  °C.

Dinámica de movimiento de nanobots a través de microscopía óptica.

Los vídeos ópticos de nanobots se adquirieron utilizando un microscopio Leica Thunder, junto con una cámara CCD de alta velocidad Hamamatsu y un objetivo de ×1.25. Para ello, los nanobots fueron centrifugados y resuspendidos en 50 μl de PBS (concentración final de 20 mg ml^-1). Luego, se llenó una placa de Petri con 3 ml de PBS o una solución de urea 300 mM (en PBS) y se observó bajo el microscopio. Una gota de 5 μl con nanobots (20 mg ml^-1) luego se añadió a la placa de Petri llena de líquido y se grabaron vídeos a 25 fotogramas por segundo. Las distribuciones de intensidad de píxeles de vídeo en las regiones de interés se analizaron a intervalos de 15 segundos utilizando el software ImageJ.

Radiomarcado de nanobots con [¹⁸F]F-PyTFP

Síntesis de [¹⁸F]F-PyTFP

[¹⁸F]F-PyTFP se sintetizó en un módulo Neptis xSeed (Aplicaciones radioquímicas optimizadas), siguiendo un método informado anteriormente³³.

Síntesis de ¹⁸Nanobots marcados con F

Los nanobots fueron etiquetados con [¹⁸F]F-PyTFP, sobre la base de un procedimiento previamente establecido con modificaciones menores³³. En resumen, 200 μl de solución de nanobot (1 mg ml^-1) se centrifugó (10 min, 13,853g), resuspendido en 10 μl de PBS (1 mM, pH 8), y se incuba con 4 μl de [¹⁸F]F-PyTFP en acetonitrilo (aproximadamente 37 MBq) durante 35 min a temperatura ambiente. Después de la incubación, la mezcla de reacción se diluyó con agua (200 µl) y se purificó por centrifugación (5 min, 13,853g). Luego, el sedimento resultante se enjuagó tres veces con agua antes de medirlo en un calibrador de dosis (CPCRC-25R, Capintec). El rendimiento radioquímico se calculó como la relación entre la cantidad de radiactividad presente en los nanobots después del lavado y la cantidad inicial de radiactividad. La pureza radioquímica después de la purificación fue ≥99%, según lo determinado por radiocromatografía en capa fina (radio-TLC) utilizando papel de cromatografía iTLC-SG (Agilent Technologies) y diclorometano y metanol (2:1) como fases estacionaria y móvil, respectivamente. Las placas de TLC se analizaron utilizando un lector de TLC (MiniGITA, Raytest).

Estabilidad de ¹⁸F-nanobots

la estabilidad de ¹⁸Los nanobots marcados con F se determinaron utilizando los siguientes medios: (1) urea 300 mM, (2) agua y (3) orina de animales con tumores. ¹⁸Los nanobots marcados con F (10 μl) se incubaron con la solución correspondiente (100 μl) durante 1 h a temperatura ambiente. Luego, los nanobots y el sobrenadante se separaron mediante centrifugación y se recogieron, y se midió la radioactividad en un calibrador de dosis (CPCRC-25R).

Radiomarcado de nanobots con ¹³¹I

La radioyodación de nanobots de ureasa se realizó incubando nanobots con inyectables.¹³¹I]Solución de NaI (925 MBq ml^-1; GE HealthCare). En resumen, 400 μl de solución de nanobot de ureasa (1 mg ml^-1) fue centrifugado (13,853g, 5 min), se resuspendió en 100 μl de PBS (10 mM, pH 7.4) y se incubó con 25 μl o 185 μl de inyectable [¹³¹I]NaI (alrededor de 42.55 o 277.5 MBq, respectivamente) durante 30 min, dependiendo de la actividad final deseada. Después de la incubación, la mezcla de reacción se purificó por centrifugación (13,853g, 5 minutos). El precipitado resultante se lavó tres veces con agua (100 µl). La radiactividad en el sobrenadante y el precipitado se determinó utilizando un calibrador de dosis (CPCRC-25R), y ambas fracciones se analizaron mediante radio-TLC, al igual que para ¹⁸F-nanobots.

Desarrollo de modelos animales

Los ratones se mantuvieron y manipularon de acuerdo con la Directiva del Consejo Europeo 2010/63/UE y directrices internas. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el comité de ética de CIC biomaGUNE y las autoridades locales (Diputación Foral de Guipuzcoa, PRO-AE-SS-276). El análisis de imágenes (tanto PET como MRI) estaba cegado en cuanto a la distribución grupal de los animales.

El modelo murino ortotópico de cáncer de vejiga se generó mediante administración intravesical de células MB49 (línea celular de carcinoma de vejiga murino) a ratones hembra C57BL/6JRj (8 semanas de edad, Janvier). Para los experimentos destinados a determinar la acumulación de tumores (cuatro grupos; detalles a continuación), se inocularon seis animales por grupo, según se determinó mediante análisis de precisión, con las siguientes suposiciones: precisión requerida, 20%; SD esperada, ±20%; confianza, 95%; pérdida de animales, 20%. Para los experimentos de eficacia terapéutica (seis grupos; detalles a continuación), se incluyeron diez animales por grupo, según se calculó utilizando un método de Student de una cola. t-prueba, diferencia entre dos medias independientes, con los siguientes supuestos: hipótesis nula, el tratamiento no afecta el crecimiento tumoral; α, 0.05; 1 - β, 0.95; DE, ±50%; diferencias esperadas entre grupos, 50%; pérdida de animales, 20%. Como el experimento se realizó en dos lotes por razones operativas, se incluyó un grupo de control en ambos lotes (Tabla 2), y luego se agruparon todos los animales. Para el establecimiento del tumor, los ratones fueron anestesiados mediante inhalación de isoflurano al 3% en O puro.₂ y mantenido con 1.0–1.5% de isoflurano en 100% O₂. Luego, se vació la vejiga y se indujeron lesiones químicas en el urotelio mediante la instilación intravesical de 50 µl de poli-l-lisina (Sigma-Aldrich) a través de un catéter calibre 24 durante 15 min. Posteriormente, se vació nuevamente la vejiga y las células MB49 (10⁵ Se instilaron células) en DMEM con alto contenido de glucosa (100 μl) durante 1 h antes de retirar el catéter y vaciar la vejiga mediante masaje abdominal. A lo largo de los experimentos, los ratones fueron monitoreados y pesados ​​para controlar su salud y bienestar. Se aplicó un criterio de valoración en humanos si la pérdida de peso excedía el 20% o en base a síntomas clínicos, bajo criterio del veterinario a cargo.

Seguimiento del tamaño del tumor

Los estudios de resonancia magnética se realizaron 7 y 14 días después de la inducción del tumor, utilizando un escáner Bruker BioSpec USR 7/70 de 30 T (Bruker BioSpin) equipado con un inserto de gradiente BGA-12S de 440 mT m.^-1 y un resonador QSN 112/086 (T12053V3) para radiofrecuencia¹⁴ transmisión y una bobina de superficie de cerebro de rata (T11205V3) para recepción de RF (ambas funcionando a 300 MHz). Los animales fueron anestesiados con isoflurano (4% para inducción y 1.5% para mantenimiento en un 50% O₂/50% norte₂ mezcla) y se coloca en una base compatible con MR. La temperatura corporal y la frecuencia respiratoria se monitorearon continuamente utilizando un dispositivo de monitoreo compatible con RM (modelo 1030 SA, Small Animal Instruments), conectado a un sistema de calentador de aire para roedores pequeños para mantener la temperatura corporal. Después de adquirir imágenes de referencia, se utilizó una secuencia de imágenes ponderadas por difusión basada en eco de espín para obtener imágenes de tumores, utilizando los siguientes parámetros: tiempo de eco (T_E) = 22.3 ms, tiempo de repetición (T_R) = 2,500 ms, n = 2 promedios, una imagen A0 (imagen basal con b = 0 s mm^-2) y una imagen DW adquirida utilizando gradientes de difusión en la dirección (1, 0, 0) con una duración de gradiente δ = 4.5 ms y una separación de gradiente Δ = 10.6 ms, dando b = 650 s mm^-2, un 16 × 16 mm² campo de visión, tamaño de matriz de imagen de 160 × 160 puntos, 20 cortes consecutivos de 0.5 mm de espesor (sin espacios, adquiridos en modo intercalado) y un ancho de banda de 192.9 Hz por píxel. Para visualizar los tumores, las imágenes se postprocesaron con el software ImageJ, dividiendo las imágenes adquiridas con un gradiente de difusión (b = 650 s mm^-2) por los adquiridos sin (b = 0 s mm^-2), y aplicando un filtro gaussiano 3D (σ_x = σ_y = σ_z = 0.7) al resultado. Los tumores se delinearon manualmente para determinar su volumen.

Biodistribución in vivo

El día 15 después de la inducción del tumor, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en cuatro grupos para obtener distribuciones promedio homogéneas del volumen del tumor entre los grupos. Las exploraciones PET-CT (escáneres MOLECUBES β y X-CUBE) se adquirieron 3 h después de administrar intravesicalmente 100 μl de ¹⁸F-BSA (grupos 1 y 2) o ¹⁸Nanobots de F-ureasa (grupos 3 y 4) en una concentración de 200 μg ml^-1, utilizando agua (grupos 1 y 3) o urea 300 mM en agua (grupos 2 y 4) como vehículo (Tabla 1). Para la adquisición de imágenes, los animales fueron inducidos con anestesia (5% de isoflurano en oxígeno puro) y colocados en posición supina antes de masajear la región abdominal para la evacuación de la vejiga. Acto seguido, el correspondiente ¹⁸Nanobots marcados con F (¹⁸F-BSA/¹⁸F-ureasa en agua/urea) se instilaron en la vejiga a través de un catéter de calibre 24 y se incubaron durante 1 h, antes de retirar el catéter, vaciar la vejiga y dejar que los ratones se recuperaran de la anestesia. En t = 3 h después de la administración, los animales se volvieron a anestesiar y se adquirieron imágenes PET estáticas de todo el cuerpo durante 10 min, seguidas de tomografías computarizadas. Las imágenes PET se reconstruyeron utilizando el algoritmo de reconstrucción de maximización de expectativas de subconjuntos ordenados en 3D con correcciones aleatorias, de dispersión y de atenuación. Las imágenes PET-CT del mismo ratón se registraron y analizaron conjuntamente utilizando la herramienta de procesamiento de imágenes PMOD. Se obtuvieron gráficos de concentración de radiactividad frente al tiempo creando un volumen de interés en la región superior de la vejiga utilizando una herramienta de contorno 3D y midiendo la actividad (desintegración corregida) en kilobecquerelios por órgano. Los resultados se corrigieron aplicando un factor de calibración y luego se normalizaron mediante el volumen del tumor derivado de la resonancia magnética.

Estudios ex vivo

Análisis histopatológicos

Después de completar todas las imágenes, las vejigas seleccionadas (n = 3 por grupo) de animales sanos y portadores de tumores se retiraron en condiciones asépticas y se fijaron inmediatamente en formaldehído al 4%. Luego, las vejigas se incluyeron en parafina antes de tomar secciones de 2 a 3 µm para la tinción con hematoxilina-eosina. Se obtuvieron imágenes representativas de todas las condiciones para el examen histopatológico.

Análisis ICP-MS

Las mediciones se realizaron en un Thermo iCAP Q ICP-MS (Thermo Fisher Scientific) acoplado con un muestreador automático ASX-560 (CETAC Tech). Después de completar todas las imágenes, se sacrificaron los animales y se seleccionaron las vejigas (n = 2 por grupo; cuatro grupos) recogidos y digeridos en 1 ml de HNO₃:HCl (mezcla 4:1). La dispersión se hirvió hasta que los órganos se disolvieron por completo. Luego, la solución se enfrió a temperatura ambiente y se analizó mediante ICP-MS para determinar la concentración de Au en cada muestra, transformando los resultados en porcentajes de dosis inyectada por gramo de tejido (%ID g^-1).

Inmunohistoquímica y microscopía confocal.

Para los análisis de inmunohistoquímica, los animales portadores de tumores recibieron nanobots marcados con FITC en agua o urea 300 mM (n = 4 por grupo), como se describió anteriormente, para estudios PET-CT. Además, los animales portadores de tumores sin nanobots sirvieron como grupo de control (n = 2). En todos los casos, las vejigas se recogieron, se congelaron y se cortaron en secciones de 10 µm que se fijaron inmediatamente en formaldehído al 10 % durante 15 min, se lavaron con PBS 10 mM y luego se incubaron en NH50 XNUMX mM.₄Cl en PBS durante 5 minutos antes de enjuagar nuevamente con PBS. La permeabilización se realizó con metanol:acetona (1:1) durante 5 min a temperatura ambiente y Triton al 0.1% en PBS durante 5 min. Después del lavado con PBS, las muestras se saturaron con una solución de BSA al 5 % y Tween al 0.5 % en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anti-FITC de ratón (1:100, Abcam) en BSA al 5 %. –0.5% Interpolación. Las secciones se lavaron tres veces con PBS 10 mM durante 5 min y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario IgG anti-ratón de burro Alex Fluor 647 (Molecular Probes, Life Technologies, 1:1,000) en BSA al 5 % – Tween al 0.5 %. en PBS, se lavó nuevamente en PBS (3 × 5 min) y se montó con un kit antifade ProLong con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Molecular Probes, Life Technologies). Las imágenes se adquirieron con un microscopio confocal Leica STELLARIS 5 (Parque Científico UPV/EHU) con ajustes idénticos para todas las secciones: aumento de ×10 con imágenes en mosaico y costura (normalmente campo de visión de 4 × 5). La línea láser y las ventanas de detección fueron 405 nm y 440–503 nm para DAPI, 489 nm y 494–602 nm para el láser blanco FITC y 653 nm y 660–836 nm para el láser blanco Alexa647.

limpieza óptica

Después de la perfusión con paraformaldehído al 4% y PBS, se extrajeron muestras de vejiga y se fijaron adicionalmente en paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 °C, luego se incluyeron en una jeringa de 5 ml con agarosa de bajo punto de fusión al 0.8% para formar un bloque cilíndrico y permitir una fácil montaje en la cubeta de cuarzo. Todo el bloque se deshidrató progresivamente utilizando metanol:H₂O a 4 °C (30%:70% durante 1 h, 50%:50% durante 1 h, 70%:30% durante 1 h, 100%:0% durante 1 h, luego 100% metanol durante la noche y nuevamente durante 4 h) y finalmente se sumergen en alcohol bencílico-benzoato de bencilo (BABB) como solución de coincidencia de índice de refracción para imágenes. Para comparaciones in vitro de nanobots FITC verdes con partículas rojas comerciales, utilizamos nanopartículas de sílice fluorescente roja DiagNano (Creative Diagnostics), de 1  µm de diámetro, resistentes al aclaramiento BABB.

Autofluorescencia e imágenes sLS polarizadas.

Las imágenes con láminas de luz se realizaron en MacroSPIM, un sistema personalizado para imágenes claras de órganos completos desarrollado en el IRB Barcelona^44,45. En resumen, las muestras se incrustan en un bloque de agarosa, se limpian junto con la muestra y se obtienen imágenes dentro de una cubeta de cuarzo. Las imágenes de autofluorescencia utilizaron láseres a 488, 561 o 638 nm que suministran iluminación a través de una lente cilíndrica doblete acromática de 50 mm (ACY254-050-A, Thorlabs). Para reducir los artefactos de rayas, la lámina de luz se gira con un escáner resonante SC-10 (EOPC) a lo largo de un telescopio 4f con lentes doblete acromáticas G322288322 de 100 mm (QI Optic Photonics). La autofluorescencia del tejido se recoge a través de filtros de fluorescencia de paso largo o de banda y se registra con una cámara ORCA Flash v2 (Hamamatsu Photonics). Las imágenes se realizaron a ×9.6 con un zoom de ×8, una lente de ×2 y una lente de tubo de ×0.6. La lámina de luz se aplanó en todo el campo de visión, lo que produjo una resolución axial de 5 a 6 µm. Las imágenes 3D se realizaron en pasos de 2.5 µm. Las imágenes de toda la vejiga se realizaron en 2 × 3 o 3 × 4 XY mosaicos, dependiendo del tamaño del órgano.

Las imágenes de sLS se lograron quitando el filtro de fluorescencia o usando cualquier filtro que transmitiera el láser. El giro de la lámina de luz redujo el ruido moteado del láser, lo que resultó en un promedio temporal de la coherencia del láser, como se mostró anteriormente⁵². La orientación de la polarización lineal de la hoja de luz en la iluminación se controló girando una placa de media onda (AHWP05M-600, Thorlabs) antes del escáner de pivote. La señal detectada se seleccionó en polarización usando un polarizador lineal giratorio (LPVISC100, Thorlabs) antes de la rueda de filtros en la detección, introduciendo una pérdida de intensidad> 50% en la detección de fluorescencia. Si bien la distribución de la señal sLS en general cambia con la orientación del polarizador, la señal de autofluorescencia del tejido no se ve afectada por la rotación del polarizador. sLS produce una resolución espacial de 2.4 ± 0.3 μm en BABB, que es comparable a la resolución en imágenes de láminas de luz fluorescente (confirmada ajustando una función gaussiana a la XY Respuesta de imagen de una sola partícula, figura complementaria. 8l–m) y cercana a la resolución teórica en el aire (1.53 μm con apertura numérica (NA) = 0.2 con zoom macro máximo ×8).

Procesamiento de imágenes y análisis 3D.

El procesamiento de imágenes, la segmentación y el análisis de conjuntos de datos de hojas de luz se realizaron con ImageJ/Fiji, mientras que las Figs. 3 y 4 fueron generados con Imaris Viewer 9.9 (https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer) y vídeo complementario 3 fue generado con Imaris 9 (https://imaris.oxinst.com/) (Bitplane, Oxford Instruments). Los conjuntos de datos de láminas de luz en mosaico se unieron con MosaicExplorerJ⁵³. La segmentación 3D del tejido de la vejiga se realizó utilizando macros ImageJ/Fiji personalizadas para la anotación 3D semiautomática de grandes volúmenes en modo virtual. En resumen, un primer script, 'Macro1', carga pilas de imágenes 3D, permite que el usuario anote las regiones de interés en varios planos e interpola automáticamente las regiones de interés para generar y exportar máscaras 3D. Las ROI se dibujaron cada 15 planos (cada 37.5 µm) para facilitar una buena continuidad de la segmentación y al mismo tiempo mantener las anotaciones en un mínimo razonable. Un segundo script, 'Macro2', realiza las operaciones matemáticas o booleanas, plano por plano sin cargar todas las pilas en la memoria, ya sea entre máscaras 3D o entre una máscara 3D y los datos originales, guardando el resultado como una nueva pila. Todas las máscaras se generaron anotando imágenes de autofluorescencia.

Tanto las capas superficiales del tejido tumoral como las sanas (Fig. 3) se delinearon utilizando la varita de Fiji y las herramientas de lazo en la cavidad de la vejiga con una máscara. Al llamar a esta primera iteración BC1, las ejecuciones posteriores de Macro1 dilatan automáticamente este contorno 3D en una cantidad de píxeles definida para generar nuevas iteraciones de máscara, BC2, BC3, etc., con dilataciones crecientes. La primera capa que contiene tejido tumoral y sano, máscara L1, se obtiene restando la máscara BC1 de BC2 y así sucesivamente, dando L2 y L3 como capas concéntricas. El volumen del tumor más cercano a la cavidad se obtuvo anotando el tumor con varita y herramientas de lazo para crear una máscara T1, mientras que la capa 3D de urotelio sano se detectó por separado en la máscara U1. Restar U1 de L1 produce la capa superficial del tumor, y así sucesivamente: L2 − U1, L3 − U1. Por el contrario, la primera capa del urotelio se obtiene restando T1 de L1. Todas las capas de la Fig. 3 se definieron con un espesor de 33 μm.

Se utilizó el mismo conjunto de macros y procedimientos (herramienta de varita ImageJ, erosión digital de 500 µm, etc.) para delinear y segmentar la parte interna del tejido de la vejiga y luego estimar el volumen del tejido interno de la vejiga (Fig. 4, consulte más arriba para obtener más detalles). En Fiji se crearon histogramas de la intensidad de la señal dispersa combinando la señal dispersa y la máscara.

RNT usando ¹³¹I-nanobots

Entre los días 8 y 15 después de la implantación del tumor, los animales se dividieron en seis grupos (grupos 1 a 6), tratando de lograr volúmenes tumorales promedio similares en todos los grupos (Tabla 2). Para los experimentos, los animales fueron inducidos con anestesia (5% de isoflurano en O puro₂) y se coloca en decúbito supino antes de vaciar la vejiga masajeando la región abdominal. Inmediatamente después, 100 μl del tratamiento adecuado a una concentración de 400 μg ml^-1 (Mesa 2) se instiló en la vejiga mediante un catéter de calibre 24. El tratamiento y el vehículo (agua o urea) permanecieron en la vejiga durante 1 hora antes de retirar el catéter. La vejiga se vació nuevamente mediante masaje abdominal y los ratones se recuperaron de la anestesia en sus jaulas, reemplazando el aserrín de las jaulas de los animales 24 horas después del tratamiento para eliminar la contaminación radiactiva.

Eficacia terapéutica determinada por resonancia magnética.

Se realizaron dos estudios de resonancia magnética en cada ratón: (1) entre los días 7 y 14 después de la inoculación del tumor para aleatorizar a los animales entre los grupos y medir los volúmenes tumorales iniciales (pretratamiento); (2) entre los días 16 y 21 después de la inoculación del tumor (post-tratamiento) para evaluar la eficacia terapéutica. La resonancia magnética se realizó utilizando los escáneres Bruker BioSpec de 7 T y Bruker BioSpec de 11.7 T (ambos con software ParaVision 7), según la disponibilidad. Esto no afectó los resultados ya que el campo externo no es crítico para las imágenes anatómicas.¹⁴. Los experimentos de imágenes se realizaron utilizando los mismos parámetros de imágenes y procesamiento como se explicó anteriormente (Seguimiento del tamaño del tumor). En el caso del escáner de 11.7 T, la configuración consistía en una bobina de superficie del corazón de ratón para la recepción y una bobina volumétrica para la transmisión. Los volúmenes tumorales en cada corte se determinaron a partir de volúmenes de interés extraídos manualmente que cubrían el área del tumor.

análisis estadístico

En estudios de imágenes PET, porcentajes de dosis inyectada (% ID) y dosis inyectada por volumen de tumor (% ID cm^-3) se compararon mediante ANOVA unidireccional. Las diferencias entre grupos se determinaron mediante la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. El NTV en la sección RNT se obtuvo de un t-prueba de valores no apareados. Se asumió que la distribución de los datos era normal, pero esto no se probó formalmente. Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism v.8.

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de la cartera de naturaleza vinculado a este artículo.

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01577-y