El descubrimiento durante el Proyecto Genoma Humano a principios de la década de 2000 de que los humanos tenemos sólo unos 20,000 genes codificadores de proteínas (aproximadamente tantos como los diminutos gusanos nematodos que habitan en el suelo y menos de la mitad que la planta de arroz) fue un shock. . Sin embargo, ese golpe a nuestro orgullo se vio mitigado por la idea de que el genoma humano es rico en conexiones regulatorias. Nuestros genes interactúan en una densa red, en la que fragmentos de ADN y las moléculas que codifican (ARN y proteínas) controlan la “expresión” de otros genes, influyendo en si producen sus respectivos ARN y proteínas. Para comprender el genoma humano, necesitábamos comprender este proceso de regulación genética.

Sin embargo, esa tarea está resultando mucho más difícil que decodificar la secuencia del genoma.

Inicialmente, se sospechaba que la regulación genética era una simple cuestión de que un producto genético actuaba como un interruptor de encendido/apagado para otro gen, de forma digital. En la década de 1960, los biólogos franceses François Jacob y Jacques Monod dilucidaron por primera vez un proceso regulador de genes en detalle mecanicista: en Escherichia coli En las bacterias, cuando una proteína represora se une a un determinado segmento de ADN, bloquea la transcripción y traducción de un conjunto adyacente de genes que codifican enzimas para digerir el azúcar lactosa. Este circuito regulador, que Monod y Jacob denominaron el laca operón, tiene una lógica clara y transparente.

Pero la regulación genética en metazoos complejos (animales como los humanos, con células eucariotas complejas) generalmente no parece funcionar de esta manera. En cambio, se trata de un grupo de moléculas, incluidas proteínas, ARN y fragmentos de ADN de todo un cromosoma, que de alguna manera colaboran para controlar la expresión de un gen.

No se trata sólo de que este proceso regulador en los eucariotas tenga más participantes de los que normalmente se observan en las bacterias y otras células procarióticas simples; parece ser un proceso categóricamente diferente y más confuso.

Un equipo de la Universidad de Stanford, liderado por el biofísico y bioingeniero polly fordyce, parece haber descubierto ahora un componente de este modo difuso de regulación genética. Su trabajo, publicado el pasado mes de septiembre en Ciencia:, sugiere que el ADN cerca de un gen actúa como una especie de pozo poco profundo para atrapar diversas moléculas reguladoras, manteniéndolas listas para la acción para que, cuando sea necesario, puedan sumar su voz a la decisión sobre si activar el gen.

Estos pozos reguladores están hechos de tramos de ADN decididamente extraños. Consisten en secuencias en las que un tramo corto de ADN, de uno a seis pares de bases de longitud, se repite muchas veces. Se pueden encadenar decenas de copias de estas “repeticiones cortas en tándem” (STR, por sus siglas en inglés) en estas secuencias, como la misma pequeña “palabra” escrita una y otra vez.

Los STR abundan en el genoma humano: comprenden aproximadamente el 5% de todo nuestro ADN. Alguna vez se pensó que eran ejemplos clásicos de ADN "basura" porque un "texto" de ADN repetitivo compuesto únicamente de STR no puede contener tanta información significativa como, por ejemplo, la secuencia irregular de letras que componen una oración en este caso. artículo.

Y, sin embargo, los STR claramente no son insignificantes: se han relacionado con dolencias como la enfermedad de Huntington, la atrofia muscular espinobulbar, la enfermedad de Crohn y algunos cánceres. Durante las últimas dos décadas, se ha acumulado evidencia de que de alguna manera pueden mejorar o inhibir la regulación genética. El misterio era cómo podían ser tan poderosos con tan poco contenido informativo.

Controles complejos para células complejas

Para comprender cómo encajan los STR en el panorama general de la regulación genética, retrocedamos un paso. Los genes suelen estar flanqueados por fragmentos de ADN que no codifican ARN ni proteínas, pero que tienen funciones reguladoras. Los genes bacterianos tienen regiones "promotoras" donde las enzimas polimerasas pueden unirse para comenzar la transcripción del ADN adyacente en ARN. También tienen habitualmente regiones "operadoras", donde las proteínas represoras pueden unirse para bloquear la transcripción, desactivando un gen, como en el laca operón

En humanos y otros eucariotas, las secuencias reguladoras pueden ser más numerosas, variadas y desconcertantes. Las regiones llamadas potenciadores, por ejemplo, afectan la probabilidad de que se transcriba un gen. Los potenciadores suelen ser el objetivo de proteínas llamadas factores de transcripción, que pueden unirse para estimular o inhibir la expresión genética. Curiosamente, algunos potenciadores están a decenas de miles de pares de bases de los genes que regulan, y sólo se acercan a ellos mediante la reordenación física de los bucles de ADN en un cromosoma empaquetado.

La regulación de los genes eucariotas normalmente implica estos diversos bloques reguladores de ADN, junto con uno o más factores de transcripción y otras moléculas, todos reunidos alrededor de un gen como un comité convocado para decidir qué debe hacer. Se congregan en un grupo denso y suelto.

A menudo, los participantes moleculares tampoco parecen interactuar a través de los altamente selectivos pares de “llave y candado” comunes en la biología molecular. Por el contrario, son mucho menos selectivos e interactúan de forma bastante débil y no selectiva, como si deambularan y entablaran breves conversaciones entre ellos.

De hecho, cómo se unen los factores de transcripción al ADN en eucariotas ha sido un misterio. Durante mucho tiempo se supuso que alguna parte de un factor de transcripción debía coincidir estrechamente con una secuencia “motivo” de unión en el ADN, como las piezas de un rompecabezas. Pero aunque se han identificado algunos de estos motivos, su presencia no siempre se correlaciona muy bien con el lugar donde los científicos encuentran factores de transcripción adheridos al ADN en las células. A veces, los factores de transcripción permanecen en regiones sin ningún motivo, mientras que algunos motivos que parecen unirse fuertemente a los factores de transcripción permanecen vacíos.

"Tradicionalmente en genómica, el objetivo ha sido clasificar los sitios genómicos de forma [binaria] como 'unidos' o 'no unidos'" mediante factores de transcripción, dijo Fordyce. "Pero el panorama tiene muchos más matices que eso". Los miembros individuales de esos “comités” reguladores de genes no parecen estar invariablemente presentes o ausentes en sus reuniones, sino que tienen diferentes probabilidades de estar presentes o no.

La tendencia de la regulación genética en eucariotas a depender de tantas interacciones débiles y diversas entre grandes complejos moleculares "es una de las cosas que hace que sea notoriamente difícil de manejar teóricamente", dijo el biofísico. Thomas Kuhlman de la Universidad de California, Riverside, quien escribió un comentario en el artículo del laboratorio Fordyce para Ciencia:. Es un profundo enigma cómo, a partir de este proceso aparentemente caótico, surgen decisiones precisas sobre cómo activar y desactivar genes.

Más allá de la misteriosa y confusa lógica de ese proceso de decisión, también está la cuestión de cómo todos los miembros del comité encuentran el camino a la habitación correcta y luego permanecen allí. Las moléculas generalmente se mueven alrededor de la célula por difusión, sacudidas por todas las demás moléculas circundantes, como el agua, y deambulando en direcciones aleatorias. Podríamos esperar que estos comités flexibles se separen demasiado rápido para realizar su trabajo regulatorio.

Ahí es donde entran en juego los STR, piensan Fordyce y sus colegas. Los STR son sorprendentemente comunes dentro de los sitios potenciadores del ADN. En su artículo, los investigadores sostienen que los STR actúan como parches pegajosos que convocan factores de transcripción y evitan que se desvíen.

Ajustar la adherencia

El grupo de Fordyce investigó sistemáticamente cómo las diferencias en la secuencia STR influyen en la adherencia de los factores de transcripción a un motivo de unión. Observaron dos factores (uno de levadura y otro de humanos) que se adhieren a un motivo particular de seis bases. Los investigadores midieron tanto la fuerza (o afinidad) de esa unión como la velocidad a la que los factores de transcripción se atascan y despegan (cinética) cuando el motivo está flanqueado por un STR en lugar de una secuencia aleatoria. A modo de comparación, observaron la facilidad con la que los factores se unen solo al STR y a una secuencia de ADN totalmente aleatoria.

"Uno de los mayores desafíos de este campo es desenredar las innumerables variables que impactan la unión [del factor de transcripción] en una posición específica del genoma", dijo David Suter, biólogo molecular del Instituto Federal Suizo de Tecnología de Lausana en Suiza. La forma del ADN, la proximidad a otros segmentos de ADN y la tensión física en las moléculas de ADN pueden desempeñar un papel en la unión del factor de transcripción. Los valores de estos parámetros probablemente difieren en cada posición del genoma, y ​​tal vez también entre tipos de células y dentro de una sola célula a lo largo del tiempo en una posición determinada. "Este es un vasto espacio de variables desconocidas que son muy difíciles de cuantificar", dijo Suter.

Por eso son tan útiles experimentos bien controlados como los del equipo de Stanford, añadió Kuhlman. Por lo general, cuando los investigadores necesitan medir interacciones débiles como estas, tienen dos opciones: pueden hacer algunas mediciones muy detalladas y extremadamente precisas y generalizar a partir de ellas, o pueden tomar muchas mediciones rápidas y sucias y utilizar matemáticas complejas. métodos estadísticos para deducir resultados. Pero Fordyce y sus colegas, dijo Kuhlman, utilizaron un procedimiento automatizado basado en un chip de microfluidos para tomar mediciones precisas durante experimentos de alto rendimiento "para obtener lo mejor de ambos mundos".

El equipo de Stanford descubrió que diferentes secuencias STR pueden alterar las afinidades de unión de los factores de transcripción al ADN hasta en un factor de 70; a veces tienen más impacto en la unión del factor de transcripción que cambiar la secuencia del propio motivo de unión. Y los efectos fueron diferentes para los dos factores de transcripción diferentes que observaron.

Por lo tanto, los STR parecen capaces de ajustar la capacidad de los factores de transcripción para acoplarse a un sitio del ADN y así regular un gen. ¿Pero cómo exactamente?

Una sala de espera cerca de un gen

Los investigadores calcularon que la parte de un factor de transcripción que se une al ADN podría interactuar débilmente con un STR, y la fuerza exacta de esa afinidad depende de la secuencia del STR. Debido a que dicha vinculación es débil, no tendrá mucha especificidad. Pero si un STR agarra y libera un factor de transcripción una y otra vez, el efecto acumulativo es mantener el factor de transcripción en las proximidades del gen para que sea más probable que se una de forma segura a la región del motivo si es necesario.

Fordyce y sus colegas predijeron que los STR actúan como un “lobby” o pozo donde los factores de transcripción pueden reunirse, aunque sea de manera transitoria, cerca de un sitio de unión reguladora. "La naturaleza repetitiva de un STR amplifica el efecto débil de cualquier sitio de unión del que esté compuesto", dijo Connor Horton, el primer autor del estudio, que ahora es estudiante de doctorado en la Universidad de California, Berkeley.

Por el contrario, añadió, algunos STR también pueden actuar para alejar los factores de transcripción de las secuencias reguladoras, absorbiendo factores de transcripción en otros lugares como una esponja. De esta forma, pueden inhibir la expresión genética.

El trabajo, dijo Suter, "muestra de manera convincente que los STR afectan directamente la unión de los factores de transcripción in vitro". Es más, el equipo de Stanford utilizó un algoritmo de aprendizaje automático para demostrar que los efectos observados en sus experimentos in vitro también parecen ocurrir en células vivas (es decir, in vivo).

Pero Roberto Tjian, bioquímico de Berkeley e investigador del Instituto Médico Howard Hughes, cree que puede ser demasiado pronto para estar seguro de qué influencia tiene una determinada combinación de factores de transcripción STR sobre la expresión genética en células reales.

Tjian, Xavier Darzacq y sus colegas en el laboratorio que dirigen juntos en Berkeley coinciden en que los STR parecen ofrecer una forma de concentrar factores de transcripción cerca de los sitios reguladores de genes. Sin embargo, sin saber qué tan cerca deben estar los factores para activar la transcripción, es difícil comprender el significado funcional de ese resultado. Tjian dijo que le gustaría ver si la introducción de un STR en una célula viva influye de manera predecible en la expresión de un gen diana. Actualmente, dijo, “no está convencido de que los ROS vayan a ser necesariamente un aspecto importante de los mecanismos [regulatorios] in vivo”.

Una gramática combinatoria

Un enigma persistente es cómo dicho mecanismo proporciona de manera confiable el tipo de regulación genética precisa que las células necesitan, ya que tanto la fuerza como la selectividad de la unión del factor de transcripción dentro de los pocillos STR son débiles. Fordyce cree que esa especificidad de influencia podría provenir de muchas fuentes, no sólo de diferencias en las secuencias STR sino también de interacciones cooperativas entre factores de transcripción y otras proteínas involucradas en la regulación.

Teniendo en cuenta todo esto, dijo Horton, no está claro que sea sencillo predecir el efecto de una determinada combinación de factor de transcripción STR sobre la expresión de un gen. La lógica del proceso es ciertamente confusa. Y la “gramática” de la influencia probablemente sea combinatoria, añadió Horton: el resultado depende de diferentes combinaciones de factores de transcripción y otras moléculas.

El equipo de Stanford cree que quizás el 90% de los factores de transcripción son sensibles a los STR, pero que hay muchos más tipos de factores de transcripción en el genoma humano que tipos de STR. "La mutación de una secuencia STR podría afectar la unión de 20 factores de transcripción diferentes en ese tipo de célula, lo que llevaría a una disminución general en la transcripción de ese gen cercano sin implicar ningún factor de transcripción específico", dijo Horton.

De hecho, el equipo de Stanford está de acuerdo con Tjian en que la regulación genética en las células vivas no estará impulsada por un mecanismo único y simple. Más bien, los factores de transcripción, sus sitios de unión al ADN y otras moléculas reguladoras pueden unirse en grupos densos que ejercen su influencia colectivamente.

"Ahora hay múltiples ejemplos que respaldan la idea de que los elementos del ADN pueden abarrotar los factores de transcripción hasta el punto de formar condensados ​​con cofactores", dijo Richard Young, biólogo celular del Instituto Whitehead del Instituto Tecnológico de Massachusetts. Los potenciadores unen muchos factores de transcripción para producir ese hacinamiento. Los STR pueden ser un ingrediente que ayuda a reunir factores de transcripción para agruparlos cerca de un gen, pero no serán toda la historia.

¿Por qué regular los genes de esta manera complicada, en lugar de depender del tipo de interacciones fuertes y específicas entre las proteínas reguladoras y los sitios del ADN que dominan en los procariotas? Es posible que esa falta de claridad sea lo que hizo posibles los grandes metazoos complejos.

Para ser especies viables, los organismos deben poder evolucionar y adaptarse a circunstancias cambiantes. Si nuestras células dependieran de una red enorme pero estrictamente prescrita de interacciones reguladoras de genes, sería difícil realizar cambios en ella sin alterar todo el artilugio, del mismo modo que un reloj suizo se atascaría si eliminamos (o incluso desplazamos ligeramente) alguna de sus innumerables ruedas dentadas. Sin embargo, si las interacciones moleculares regulatorias son laxas y bastante inespecíficas, hay una holgura útil en el sistema, del mismo modo que un comité generalmente puede llegar a una buena decisión incluso si uno de sus miembros está enfermo.

Fordyce señala que en procariotas como las bacterias, puede ser relativamente fácil para los factores de transcripción encontrar sus sitios de unión porque el genoma que se busca es más pequeño. Pero eso se vuelve más difícil a medida que el genoma crece. En los grandes genomas de los eucariotas, "ya no se puede tolerar el riesgo de quedar atrapado transitoriamente en un sitio de unión 'equivocado'", dijo Fordyce, porque eso comprometería la capacidad de responder rápidamente a las condiciones ambientales cambiantes.

Además, los propios ROS son muy susceptibles de evolución. Un alargamiento o acortamiento de su secuencia, o una alteración del tamaño y la profundidad del “pozo del factor de transcripción”, puede ocurrir fácilmente debido a errores en la replicación o reparación del ADN, o mediante la recombinación sexual de los cromosomas. Para Fordyce, sugiere que los STR “pueden, por lo tanto, servir como materia prima para desarrollar nuevos elementos regulatorios y afinar los módulos regulatorios existentes para programas transcripcionales sensibles”, como los que rigen el desarrollo de animales y plantas.

El poder de las interacciones débiles

Estas consideraciones están llevando a los biólogos moleculares a prestar mucha más atención a las interacciones débiles y relativamente no selectivas en el genoma. Muchos de ellos involucran proteínas que, en lugar de tener una estructura fija y precisa, son sueltas y flexibles, “intrínsecamente desordenadas”, como dicen los bioquímicos. Si las proteínas sólo funcionaran a través de dominios estructurales rígidos, explicó Young, limitarían no sólo la evolución de los sistemas reguladores sino también los tipos de regulación dinámica que se observan en la vida. "No encontrarás un organismo vivo, ni siquiera un virus, que funcione únicamente con elementos estructurales estables como los de un reloj suizo", dijo Young.

Quizás la evolución simplemente tropezó con los STR como un componente de una solución tan compleja pero, en última instancia, más eficaz para la regulación genética en eucariotas. Los propios STR pueden surgir de varias maneras, por ejemplo, a través de errores en la replicación del ADN o la actividad de segmentos de ADN llamados elementos transponibles que hacen copias de sí mismos en todo el genoma.

"Dio la casualidad de que las interacciones débiles emergentes resultantes entre las proteínas y las secuencias repetitivas fueron algo que podría... proporcionar una ventaja selectiva a las células donde ocurrieron", dijo Kuhlman. Su suposición es que esta confusión probablemente fue impuesta a los eucariotas, pero que “posteriormente pudieron explotarla para su propio beneficio”. Las bacterias y otros procariotas pueden depender de una lógica regulatoria “digital” bien definida porque sus células tienden a existir sólo en unos pocos estados simples y distintos, como moverse y replicarse.

Pero los diferentes estados celulares de los metazoos son "mucho más complejos y a veces cercanos a un continuo", dijo Suter, por lo que se benefician de una regulación "analógica" más difusa.

"Los sistemas reguladores de genes en bacterias y eucariotas parecen haber divergido sustancialmente", coincidió Tjian. Si bien se dice que Monod comentó una vez que “lo que es cierto para E. coli Esto es cierto para el elefante”, parece que no siempre es así.