02 de abril de 2024 (Proyector Nanowerk) Microfluidos, la tecnología de controlar fluidos con precisión en una escala submilimétrica, ha prometido durante mucho tiempo revolucionar la investigación biológica y el diagnóstico médico. Al miniaturizar los ensayos en pequeñas gotas de agua en aceite, estas plataformas pueden analizar células individuales con una velocidad y eficiencia sin precedentes y, al mismo tiempo, reducir drásticamente los costos de los reactivos. Cada gota a escala de picolitro sirve como un microrreactor aislado, lo que permite estudios de alto rendimiento del comportamiento celular y diversas aplicaciones, desde la detección de fármacos hasta el análisis de células raras. Sin embargo, desbloquear todo el potencial de los microfluidos en forma de gotas se ha visto obstaculizado por el desafío de analizar rápida y exhaustivamente el contenido de estos minúsculos compartimentos. Los enfoques convencionales se basan en configuraciones de microscopía complejas y costosas, que utilizan cámaras de alta velocidad para obtener imágenes de cada gota a medida que fluye a través del dispositivo. La complejidad técnica y los elevados costos asociados con dichos sistemas han limitado la adopción generalizada de técnicas basadas en gotas en entornos clínicos y de investigación. Ahora, un equipo multidisciplinario de científicos ha desarrollado OptiDrop, un dispositivo innovador que supera ingeniosamente estas limitaciones integrando fibras ópticas directamente dentro de un chip de microfluidos. Este novedoso enfoque permite la detección de múltiples parámetros ópticos de gotas individuales y su contenido sin depender de un microscopio o una cámara. El resultado, publicado en Microsystems & Nanoengineering ("Detección de dispersión y fluorescencia multiplexada con resolución de celda única utilizando fibra óptica en chip para aplicaciones de microfluidos de gotas"), es una plataforma miniaturizada, asequible y fácil de usar que lleva el poder del análisis unicelular multiparamétrico a un formato de mesa.
a La plataforma OptiDrop comprende un chip de microfluidos con una entrada de aceite y agua para la formación de gotas en la unión de enfoque de flujo. La fase acuosa se encapsula dentro de gotitas y posteriormente fluye a través del sitio de interrogación óptica (recuadro) flanqueada por un conjunto de ranuras de fibra óptica dispuestas alrededor del canal central. Las ranuras del chip se utilizan para alojar las fibras ópticas en posiciones angulares establecidas, lo que permite una iluminación efectiva de las gotas con la luz láser incidente y la recolección de luz dispersa y señales de fluorescencia a medida que la gota pasa a través del haz de luz. La salida de fibra óptica está acoplada a un PMT para su detección. Los recuentos de pulsos TTL de cada PMT se integran mediante un chip FPGA con un contador de pulsos y se representan como datos de pico de intensidad de señal sin procesar. Los datos sin procesar se pueden analizar más a fondo para identificar o medir las intensidades de fluorescencia de las células de interés. b Unidad ensamblada de mesa con una regla de pie para báscula junto con una pantalla de visualización de flujo de datos en vivo y bombas de jeringa. (Imagen: Microsistemas y nanoingeniería, CC BY 4.0) La principal innovación de OptiDrop radica en el posicionamiento estratégico de las fibras ópticas alrededor del canal de microfluidos. A medida que cada gota pasa por el punto de interrogación, un láser la ilumina, generando señales de dispersión y fluorescencia. Estas señales ópticas se recogen de manera eficiente mediante fibras colocadas en ángulos de 45° y luego se enrutan a detectores separados. La electrónica personalizada digitaliza las señales en tiempo real, lo que permite la visualización y el análisis instantáneos del perfil óptico de cada gota.
Para validar el rendimiento de OptiDrop, los investigadores primero caracterizaron su sensibilidad y rango dinámico utilizando tintes fluorescentes estandarizados. Sorprendentemente, el dispositivo pudo detectar concentraciones de tinte tan bajas como 1 nanoMolar, rivalizando con los límites de detección alcanzados por los instrumentos convencionales y requiriendo solo una fracción del volumen de muestra. Además, la intensidad de fluorescencia medida por OptiDrop se escaló linealmente en una amplia gama de concentraciones, lo que garantiza una cuantificación precisa y fiable.
Luego, los investigadores demostraron las capacidades de OptiDrop para el análisis de partículas utilizando microperlas de diferentes tamaños e intensidades de fluorescencia como imitaciones de células. La plataforma distinguía fácilmente entre cuentas basándose tanto en sus dimensiones físicas como en sus propiedades ópticas. En particular, incluso en una mezcla heterogénea de cuentas fluorescentes tenues y brillantes, OptiDrop identificó y enumeró con precisión cada subpoblación. Esto pone de relieve la solidez del sistema a la hora de analizar muestras biológicas complejas que contienen diversos tipos de células.
Para mostrar la utilidad de la plataforma para una aplicación biológicamente relevante, el equipo realizó un ensayo de células vivas investigando la expresión superficial de proteínas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) en células inmunes. Las moléculas de MHC son reguladores cruciales de las respuestas inmunes contra patógenos y células anormales, lo que hace que sus niveles de expresión sean biomarcadores valiosos. Al aprovechar los anticuerpos marcados con fluorescencia, OptiDrop permitió la detección simultánea de proteínas MHC de clase I y II en células individuales encapsuladas dentro de gotitas. La estimulación de las células con interferón gamma, una citoquina inmunoestimuladora, provocó la regulación positiva anticipada de la expresión del MHC, que fue cuantificada con sensibilidad mediante la plataforma OptiDrop.
El desarrollo de OptiDrop marca un paso significativo hacia la democratización de las capacidades de análisis unicelulares de vanguardia. Al superar las barreras de costo y complejidad que han obstaculizado la adopción de microfluidos en gotas, esta plataforma innovadora pone poderosas herramientas de interrogación celular al alcance de una gama más amplia de investigadores y médicos. Su asequibilidad, facilidad de uso y solidez lo hacen ideal para su implementación rutinaria en laboratorios de investigación biomédica y entornos de diagnóstico en el punto de atención.
Las aplicaciones potenciales de OptiDrop son vastas y de gran alcance. En el ámbito del seguimiento de enfermedades, podría permitir la detección ultrasensible de biomarcadores raros, facilitando el diagnóstico temprano no invasivo y la evaluación de la respuesta al tratamiento. La integración con flujos de trabajo de secuenciación unicelular puede permitir la correlación directa de los fenotipos visuales con los perfiles de expresión genética, ofreciendo una comprensión más completa de los estados celulares. Además, el diseño cerrado de la plataforma y su capacidad para procesar rápidamente muestras clínicas la hacen particularmente atractiva para pruebas de enfermedades infecciosas y otras aplicaciones de diagnóstico urgentes.
Si bien OptiDrop representa un avance significativo, todavía hay espacio para una mayor optimización y expansión de sus capacidades. Aumentar el rendimiento al permitir velocidades de flujo de gotas más rápidas y generar gotas más pequeñas podría mejorar su eficiencia y escalabilidad. La integración de funcionalidades de clasificación activa permitiría a los usuarios aislar subpoblaciones de interés específicas en función de sus firmas ópticas, lo que permitiría realizar análisis moleculares posteriores. Además, el desarrollo de diseños de cartuchos estandarizados e interfaces de software intuitivas será crucial para optimizar su funcionamiento y la interpretación de datos.
A medida que nuestra comprensión de los sistemas biológicos se vuelve cada vez más matizada, herramientas como OptiDrop que integran perfectamente microfluidos, óptica y electrónica serán indispensables para desentrañar sus complejidades. Al proporcionar una plataforma accesible y versátil para análisis unicelulares de alto rendimiento, OptiDrop equipa a investigadores y médicos con una poderosa herramienta para formular nuevas preguntas, desafiar los paradigmas existentes y traducir descubrimientos innovadores en impactos significativos en el mundo real.
a La plataforma OptiDrop comprende un chip de microfluidos con una entrada de aceite y agua para la formación de gotas en la unión de enfoque de flujo. La fase acuosa se encapsula dentro de gotitas y posteriormente fluye a través del sitio de interrogación óptica (recuadro) flanqueada por un conjunto de ranuras de fibra óptica dispuestas alrededor del canal central. Las ranuras del chip se utilizan para alojar las fibras ópticas en posiciones angulares establecidas, lo que permite una iluminación efectiva de las gotas con la luz láser incidente y la recolección de luz dispersa y señales de fluorescencia a medida que la gota pasa a través del haz de luz. La salida de fibra óptica está acoplada a un PMT para su detección. Los recuentos de pulsos TTL de cada PMT se integran mediante un chip FPGA con un contador de pulsos y se representan como datos de pico de intensidad de señal sin procesar. Los datos sin procesar se pueden analizar más a fondo para identificar o medir las intensidades de fluorescencia de las células de interés. b Unidad ensamblada de mesa con una regla de pie para báscula junto con una pantalla de visualización de flujo de datos en vivo y bombas de jeringa. (Imagen: Microsistemas y nanoingeniería, CC BY 4.0) La principal innovación de OptiDrop radica en el posicionamiento estratégico de las fibras ópticas alrededor del canal de microfluidos. A medida que cada gota pasa por el punto de interrogación, un láser la ilumina, generando señales de dispersión y fluorescencia. Estas señales ópticas se recogen de manera eficiente mediante fibras colocadas en ángulos de 45° y luego se enrutan a detectores separados. La electrónica personalizada digitaliza las señales en tiempo real, lo que permite la visualización y el análisis instantáneos del perfil óptico de cada gota.
Para validar el rendimiento de OptiDrop, los investigadores primero caracterizaron su sensibilidad y rango dinámico utilizando tintes fluorescentes estandarizados. Sorprendentemente, el dispositivo pudo detectar concentraciones de tinte tan bajas como 1 nanoMolar, rivalizando con los límites de detección alcanzados por los instrumentos convencionales y requiriendo solo una fracción del volumen de muestra. Además, la intensidad de fluorescencia medida por OptiDrop se escaló linealmente en una amplia gama de concentraciones, lo que garantiza una cuantificación precisa y fiable.
Luego, los investigadores demostraron las capacidades de OptiDrop para el análisis de partículas utilizando microperlas de diferentes tamaños e intensidades de fluorescencia como imitaciones de células. La plataforma distinguía fácilmente entre cuentas basándose tanto en sus dimensiones físicas como en sus propiedades ópticas. En particular, incluso en una mezcla heterogénea de cuentas fluorescentes tenues y brillantes, OptiDrop identificó y enumeró con precisión cada subpoblación. Esto pone de relieve la solidez del sistema a la hora de analizar muestras biológicas complejas que contienen diversos tipos de células.
Para mostrar la utilidad de la plataforma para una aplicación biológicamente relevante, el equipo realizó un ensayo de células vivas investigando la expresión superficial de proteínas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) en células inmunes. Las moléculas de MHC son reguladores cruciales de las respuestas inmunes contra patógenos y células anormales, lo que hace que sus niveles de expresión sean biomarcadores valiosos. Al aprovechar los anticuerpos marcados con fluorescencia, OptiDrop permitió la detección simultánea de proteínas MHC de clase I y II en células individuales encapsuladas dentro de gotitas. La estimulación de las células con interferón gamma, una citoquina inmunoestimuladora, provocó la regulación positiva anticipada de la expresión del MHC, que fue cuantificada con sensibilidad mediante la plataforma OptiDrop.
El desarrollo de OptiDrop marca un paso significativo hacia la democratización de las capacidades de análisis unicelulares de vanguardia. Al superar las barreras de costo y complejidad que han obstaculizado la adopción de microfluidos en gotas, esta plataforma innovadora pone poderosas herramientas de interrogación celular al alcance de una gama más amplia de investigadores y médicos. Su asequibilidad, facilidad de uso y solidez lo hacen ideal para su implementación rutinaria en laboratorios de investigación biomédica y entornos de diagnóstico en el punto de atención.
Las aplicaciones potenciales de OptiDrop son vastas y de gran alcance. En el ámbito del seguimiento de enfermedades, podría permitir la detección ultrasensible de biomarcadores raros, facilitando el diagnóstico temprano no invasivo y la evaluación de la respuesta al tratamiento. La integración con flujos de trabajo de secuenciación unicelular puede permitir la correlación directa de los fenotipos visuales con los perfiles de expresión genética, ofreciendo una comprensión más completa de los estados celulares. Además, el diseño cerrado de la plataforma y su capacidad para procesar rápidamente muestras clínicas la hacen particularmente atractiva para pruebas de enfermedades infecciosas y otras aplicaciones de diagnóstico urgentes.
Si bien OptiDrop representa un avance significativo, todavía hay espacio para una mayor optimización y expansión de sus capacidades. Aumentar el rendimiento al permitir velocidades de flujo de gotas más rápidas y generar gotas más pequeñas podría mejorar su eficiencia y escalabilidad. La integración de funcionalidades de clasificación activa permitiría a los usuarios aislar subpoblaciones de interés específicas en función de sus firmas ópticas, lo que permitiría realizar análisis moleculares posteriores. Además, el desarrollo de diseños de cartuchos estandarizados e interfaces de software intuitivas será crucial para optimizar su funcionamiento y la interpretación de datos.
A medida que nuestra comprensión de los sistemas biológicos se vuelve cada vez más matizada, herramientas como OptiDrop que integran perfectamente microfluidos, óptica y electrónica serán indispensables para desentrañar sus complejidades. Al proporcionar una plataforma accesible y versátil para análisis unicelulares de alto rendimiento, OptiDrop equipa a investigadores y médicos con una poderosa herramienta para formular nuevas preguntas, desafiar los paradigmas existentes y traducir descubrimientos innovadores en impactos significativos en el mundo real.
– Michael es autor de tres libros de la Royal Society of Chemistry:
Nano-sociedad: empujando los límites de la tecnología,
Nanotecnología: el futuro es pequeñoy
Nanoingeniería: las habilidades y herramientas que hacen que la tecnología sea invisible
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