Proponemos una técnica, QolorEX, para obtener una lectura colorimétrica cuantitativa sin etiquetas con una resolución de un solo nucleótido, que puede obtener un resultado en cuestión de minutos. Este enfoque integra ensayos colorimétricos de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa basada en rojo de fenol (RT-LAMP) y amplificación de círculo rodante (RCA).3 con microfluidos de nanosuperficies plasmónicas miniaturizadas para lograr la catálisis de puntos calientes plasmónicos4. Para agilizar la reacción de amplificación, desarrollamos un cartucho de microfluidos que utiliza una actuación de microfluidos dependiente del ángulo ajustable para integrar el ciclo completo de recolección de muestras, lisis, adición de reactivos de ensayo, amplificación de ácidos nucleicos y detección (Fig. 1a). Para reducir los errores introducidos por el usuario, desarrollamos una caja de imágenes acoplada a la iluminación con actuadores automáticos para manejar, calentar y obtener imágenes del cartucho de microfluidos sin necesidad de intervención del usuario. Esta automatización permite al usuario tocar un botón en una aplicación de teléfono móvil para comenzar la operación secuencial del cartucho de microfluidos. La lectura colorimétrica es detectada automáticamente por la cámara complementaria de metal-óxido-semiconductor (CMOS) integrada con la caja de imágenes. Luego, un algoritmo de aprendizaje automático analiza la lectura y establece resultados positivos o negativos; el resultado se envía luego al teléfono móvil del usuario.
a, Un esquema del funcionamiento de QolorEX. El usuario escupe saliva en el embudo de recolección y coloca el cartucho de microfluidos dentro de la caja de imágenes. Luego, los resultados se transmiten automáticamente a través de una aplicación de teléfono inteligente. bTras la excitación de la luz, el nanomaterial plasmónico acelera el ensayo de amplificación debido al exceso de electrones en la interfaz de reacción. La mayor tasa de amplificación aumenta la tasa de producción de protones, lo que disminuye el pH del medio, lo que hace que el rojo de fenol cambie rápidamente de color de fucsia a amarillo en presencia del patógeno objetivo (que se muestra en el recuadro). dNTP, desoxirribonucleótido trifosfato; DOS, densidad de estados; E, energía; EF, Energía de Fermi; ϕensayo, energía de iniciación de la reacción de oxidación; ħω, energía fotónica; ΔV, volumen de la cámara de detección. © 2023, AbdElFatah, T. et al.
Demostramos que la lectura colorimétrica rápida obtenida con QolorEX depende en gran medida de la inyección de electrones "calientes" excitados por la luz desde la superficie de las nanopartículas plasmónicas autoensambladas en la mezcla de muestra y reactivos de ensayo en la cámara de detección. Estos electrones calientes aceleran la reacción nucleófila en el paso de polimerización de la amplificación, lo que a su vez da como resultado la transformación del color del rojo fenol de fucsia a amarillo, libre de etiquetas y dependiente del pH (Fig. 1b). Encontramos que las superficies plasmónicas con nanopartículas de 400 nm de diámetro ofrecían una mayor mejora del campo electromagnético y efectos de catálisis de puntos calientes plasmónicos asociados que las superficies plasmónicas con otros tamaños de nanopartículas, lo que resultó en una aceleración de 9 veces en la tasa de reacción de amplificación en promedio.
Validamos el sistema QolorEX usando varios virus respiratorios y bacterias. También demostramos que QolorEX puede diferenciar entre las (sub) variantes del SARS-CoV-2 al nivel del polimorfismo de un solo nucleótido. Además, QolorEX tiene un límite de detección de 5 copias de ARN por microlitro, lo que permite un diagnóstico preciso desde el inicio de la infección cuando la carga viral es baja. También analizamos 33 muestras de saliva humana positivas para SARS-CoV-2 y 15 negativas. Para estas muestras, QolorEX logró un tiempo de respuesta de muestra de 13 minutos con una precisión del 95 %, que es comparable a la prueba de PCR cuantitativa estándar de oro. La participación limitada del usuario, la alta precisión, la sensibilidad, la automatización y la rapidez de QolorEX significan que esta técnica podría abordar la necesidad de pruebas de grado PCR en entornos remotos.
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- Fuente: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01398-z
