Cultivo de células

Los adipocitos marrones se diferenciaron de una línea celular inmortalizada de preadipocitos marrones de ratón proporcionada amablemente por B. Spiegelman (Universidad de Harvard) como se describió anteriormente.¹⁹. Los preadipocitos se mantuvieron y expandieron a baja confluencia (<50%) en un medio de crecimiento (medio de Eagle modificado por Dulbecco, alto contenido de glucosa (Gibco), suplementado con suero bovino fetal al 20% (Sigma-Aldrich), HEPES 20 mM (Sigma-Aldrich). y 100 U ml^-1 penicilina-estreptomicina (Gibco)). Para la diferenciación, los preadipocitos se lavaron dos veces con solución tamponada con fosfato (PBS) (Gibco, pH 7.4, 1x), se disociaron con TrypLE Express y se sembraron a una densidad de aproximadamente 23,000 células cm-XNUMX.^-2 en el medio de crecimiento. El medio se cambió después de 24 h a un medio de diferenciación (medio de Eagle modificado por Dulbecco, alto contenido de glucosa, suplementado con suero bovino fetal al 10%, insulina 20 nM, triyodotironina 1 nM y 100 U ml).^-1 penicilina-estreptomicina) y las células se cultivaron durante 2 días. Luego se indujo la diferenciación celular mediante la adición de un medio de inducción (medio de diferenciación suplementado con indometacina 0.125 mM, dexametasona 0.5 μM e isobutilmetilxantina 0.5 mM) durante 2 días, después de lo cual el medio se cambió al medio de diferenciación durante dos días adicionales. Los adipocitos diferenciados se lavaron una vez con un medio de inanición (medio Eagle modificado por Dulbecco, bajo en glucosa (Gibco), suplementado con glucosa hasta una concentración final de 8 mM, albúmina sérica bovina al 0.5% (Sigma-Aldrich) y 100 U ml.^-1 penicilina-estreptomicina) y se incubaron durante 2 h en el medio de inanición antes del tratamiento con insulina NanoRods o NanoRods diluidos en el medio de inanición durante los tiempos indicados en el texto principal. Después del tratamiento, las células se lavaron una vez en PBS y se recogieron para aislar proteínas para inmunotransferencias o ARN para expresión génica. Para el análisis IR mediante DNA-PAINT, los preadipocitos se diferenciaron como se describió anteriormente con las siguientes modificaciones. Después del tratamiento con el medio de inducción, las células se disociaron con TrypLE Express y se sembraron en el medio de diferenciación en pocillos de fondo de vidrio μ-Slide 18 Well (ibidi). Después de 2 días, las células se incubaron con el medio de inanición durante 2 h seguido del tratamiento con insulina 10 nM en el medio de inanición durante 10 minutos. En los experimentos de control se omitió la adición de insulina. Antes del tratamiento, los adipocitos diferenciados se analizaron visualmente para evaluar la densidad de la superficie celular y la diferenciación de las células, y luego se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento y control.

Las células se mantuvieron, expandieron y diferenciaron en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO.₂ a 37°C.

PINTURA DE ADN de IR

Los adipocitos diferenciados se fijaron durante 12 min a temperatura ambiente (RT) con paraformaldehído al 4% precalentado en PBS, se lavaron tres veces con PBS, se bloquearon durante 90 min a temperatura ambiente con una solución de bloqueo (3.0% suero bovino fetal/0.1% Triton X -100 en PBS) y se incubaron con anticuerpo β anti-IR de conejo (Señalización celular (4B8); dilución 1:300 en la solución de bloqueo) durante 2 días a 4 °C. Luego, las células se lavaron tres veces con PBS y se incubaron con el nanocuerpo FluoTag-XM-QC anti-IgG de conejo (Massive Photonics) diluido 1:200 en un tampón de bloqueo (Massive Photonics) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados con PBS, las células se incubaron con nanopartículas de oro de 80 nm (Sigma-Aldrich; dilución 1:5 en el tampón de bloqueo) durante 10 minutos. Las células se lavaron una vez con PBS y se incubaron con hebras marcadas con Cy5b 3 nM (Massive Photonics) diluidas en un tampón de imagen (Massive Photonics).

Las imágenes se llevaron a cabo en un microscopio Nikon ECLIPSE Ti-E con un sistema Perfect Focus (Nikon Instruments), aplicando una configuración de fluorescencia de reflexión interna total tipo objetivo utilizando un módulo de fluorescencia de reflexión interna total circular iLAS2 (Gataca Systems) con inmersión en aceite. Objetivo de fluorescencia de reflexión interna total CFI Plan Apo de apertura numérica de 1.49 × 100 (Nikon Instruments) equipado con un aumento Optovar auxiliar de × 1.5 correspondiente a un tamaño de píxel final de 87 nm. El láser utilizado fue un OBIS 561 nm LS 150 mW (Coherent) con óptica de expansión del haz de entrada iLas personalizada (Cairn) optimizada para imágenes de superresolución de campo reducido. El haz de luz fluorescente pasó primero a través de un cubo de filtro (89901, Chroma Technology) que contenía un filtro de excitación de cuatro bandas, un filtro dicroico de cuatro bandas y un filtro de emisión de cuatro bandas (ZET405/488/561/640x, ZET405/488/561/640bs y ZET405. /488/561/640m, Tecnología Croma). Luego, la luz fluorescente se filtró espectralmente con un filtro de emisión (ET595/50m, Chroma Technology) y se tomaron imágenes en una cámara con dispositivo de carga acoplada multiplicadora de electrones iXon Ultra 888 (Andor). Se utilizó el software Micro-Manager v. 1.4 para adquirir 12,000 cuadros con un cuadro de lectura de 10 MHz, exposición de 130 ms y sin ganancia de multiplicación de electrones. Se tomaron imágenes de un total de diez células de tres experimentos independientes en cada condición (Nota complementaria y Fig. Suplementaria. 1).

Producción y purificación de ADN INS.

Insulina (Merck, 1 mg ml^-1) se hizo reaccionar con dibenzociclooctina-sulfo-N-éster hidroxisuccinimidílico (DBCO-sulfo-NHS, Click Chemistry Tools; 690 µM) en Na 100 mM₂CO₃ tampón (pH 11.5) durante 20 min a temperatura ambiente. Luego, la reacción se detuvo durante 5 minutos mediante la adición de base Tris (Sigma-Aldrich, 100 mM). La solución se lavó tres veces con 400 µl de Na 100 mM.₂CO₃ utilizando unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra de 0.5 ml con una membrana de corte de 3 kDa (Merck). En cada paso de lavado, las columnas se centrifugaron durante 10 minutos a 14,000×g. Después del paso de lavado final, se mezcló insulina-DBCO (690 µM) con ADN modificado con azida (Biómeros, 35 µM; Tabla complementaria 3) en Na 100 mM₂CO₃ y se dejó reaccionar durante 3 h a temperatura ambiente. La reacción se detuvo añadiendo NaN₃ (Sigma-Aldrich, 6.9 mM). Las muestras se procesaron en un gel de poliacrilamida nativo (6% de poliacrilamida 19:1 en 1x TAE, 20 min, 200 V, tampón de ejecución TAE) y se tiñeron con SYBR Gold (Thermo Fisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para confirmar INS- Formación de ADN. Las imágenes se realizaron utilizando un generador de imágenes en gel ImageQuant LAS 4000. El protocolo de conjugación insulina-DBCO-sulfo-NHS se optimizó para promover la unión del oligossDNA a la lisina-29 de la cadena B (lisina B29) en comparación con los grupos amina en la N Terminal de las cadenas A y B de insulina. El valor de pKa de la amina B29 es mayor que el de las aminas de los dos N terminales (11.2 frente a 8.6 y 6.8). A pH alto, se predice que el grupo NHS del reticulante reaccionará preferentemente con el grupo amina más básico, que es la lisina amina B29.³². Por lo tanto, las condiciones de reacción de pH se optimizaron para promover un único producto INS-DNA.

Las mezclas de reacción INS-DNA se purificaron mediante cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa C₁₈ columna (Agilent Poroshell 120 EC-C₁₈) en un Amersham Pharmacia Biotech ÄKTA Ettan LC. Se utilizaron el tampón A (acetato de trietilamina 50 mM) y el tampón B (90 % de acetonitrilo y 10 % de tampón A) en un perfil de gradiente, en el que el porcentaje de tampón B aumentó del 30 % al 50 % durante 20 min. Las fracciones se recogieron y se centrifugaron en un concentrador de vacío (Thermo Scientific SpeedVac Savant DNA 120) durante 30 minutos a temperatura alta para eliminar los componentes volátiles de los tampones de cromatografía líquida de alto rendimiento. Los picos seleccionados se intercambiaron con tampón en PBS usando unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra de 0.5 ml con una membrana de corte de 3 kDa (Merck), girando tres veces durante 10 minutos a 14,000 ×g y lavar cada vez con 400 µl de PBS. Se procesaron muestras de fracciones purificadas en un gel de poliacrilamida nativo y se tiñeron con SYBR Gold (Thermo Fisher) para visualizar el ADN-INS purificado. La pureza final de los conjugados se analizó para cada preparación mediante tres métodos: comparación de las intensidades de las bandas de tinción con plata (Pierce Silver Stain Kit) en electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (Invitrogen, gel Bolt al 4-12%) con estándares de insulina (Merck) , comparación de la intensidad de la banda SYBR Gold en electroforesis en gel de poliacrilamida nativa con estándares de ADN (Integrated DNA Technologies) y a través del kit de ensayo Qubit ssDNA (fluorímetro Qubit 4, Invitrogen). Las concentraciones finales de INS-DNA se calcularon en función de las mediciones de ssDNA de Qubit. El ADN-INS purificado se congeló y almacenó a -20 °C hasta su uso posterior.

Producción de NanoRods y NanoRods de insulina.

Las estructuras de origami se prepararon mezclando ADN plasmídico de andamio (p7560, Tilibit, 10 nM) con las hebras de grapas apropiadas (Integrated DNA Technologies, 100 nM) (Tablas complementarias 4–9) en un tampón de plegado (Tris 5.0 mM a pH 8.5 (Sigma-Aldrich), EDTA 1.0 mM (Panreac AppliChem) y MgCl 12.5 mM.₂ (Sigma-Aldrich)). Luego, la mezcla se colocó en un termociclador (ciclador térmico de gradiente PTC-225 de MJ Research) y se recoció calentando a 80.0 °C durante 5 min, enfriando a 60.0 °C a 1.0 °C por min durante 20 min y luego enfriando lentamente a 20.0 °C. °C a 0.5 °C por min. El exceso de grapas se eliminó utilizando unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra de 0.5 ml con una membrana de corte de 100 kDa (Merck) girando cinco veces durante 2 minutos a 14,000×.g y lavar cada vez con 400 µl del tampón de plegado. La concentración de la estructura purificada se determinó midiendo la absorbancia del ADN a 260 nm (Thermo Scientific NanoDrop 2000). Luego se añadió ADN-INS purificado en un exceso estequiométrico 3X a los sitios de unión de hebras extendidas disponibles en la estructura NanoRod y se recoció en un termociclador calentando a 37.0 °C durante 1 h, enfriando a 22.0 °C a 0.1 °C por minuto. incubando a 22.0 °C durante 14 h y enfriando a 4.0 °C a 0.1 °C por min. El ADN-IN no unido se eliminó usando unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra de 0.5 ml con una membrana de corte de 100 kDa (Merck), girando cinco veces durante 2 minutos a 14,000×.g y lavando cada vez con 400 µl de PBS + MgCl 10 mM₂. Los NanoRods de insulina se almacenaron a 4 ° C hasta su uso posterior.

Electroforesis en gel de agarosa

Las estructuras de NanoRod se analizaron ejecutando muestras en geles de agarosa en hielo durante 4 h a 70 V. Los geles estaban compuestos de agarosa al 2% (Thermo Scientific TopVision Agarose) en tampón TBE 0.5 × (Panreac AppliChem) más MgCl 10 mM.₂ (Sigma-Aldrich) y 1 × tinción SYBR Safe DNA (Invitrogen). Las imágenes se realizaron utilizando un generador de imágenes en gel ImageQuant LAS 4000.

Dispersión dinámica de la luz

Las muestras de NanoRod e insulina NanoRod se prepararon en PBS + MgCl 10 mM.₂, jeringa filtrada utilizando membranas de 0.1 µm (Merck) y analizada en un instrumento Zetasizer Ultra (Malvern Panalytical). Se tomaron tres mediciones a 25 °C en una celda de bajo volumen (ZSU1002) y luego se promediaron.

Simulación de ADNox del NanoRod

Las estructuras NR, NR-1, NR-2, NR-4, NR-7 y NR-15 se analizaron utilizando modelos de grano grueso de oxDNA (https://oxdna.org/). Se crearon estructuras NanoRod con hebras de ADNds que se extienden desde los sitios de incorporación de insulina usando vHelix y se convirtieron al formato oxDNA usando el sitio web tacoxDNA (http://tacoxdna.sissa.it/). Las estructuras fueron presentadas a la ADNox.org servidor web para simulación a 37 °C, con 1 como concentración de sal, 1 × 10⁸ pasos de tiempo con anunciot valor de 0.0001, y un paso de relajación preliminar con los parámetros predeterminados. Se visualizaron simulaciones y se realizaron videos utilizando la herramienta oxView (https://oxdna.org/).

TEM con tinción negativa

Se dispensaron NanoRods purificadas (10 nM) en una rejilla TEM de cobre con soporte de carbono y descarga luminosa (TEM-CF200CU50, Thermo Fisher Scientific) y se incubaron durante 60 s antes de retirar la solución. Luego, las rejillas se tiñeron durante 10 s con 5 µl de formiato de uranilo al 2% p/v, que posteriormente se eliminó. El procedimiento de tinción se repitió siete veces y las rejillas TEM se secaron al aire durante 30 minutos antes de obtener imágenes. Las imágenes se realizaron en un Talos 120C G2 (120 kV, detector Ceta-D) a ×92,000 1.53 para vistas de campo cercano. Las imágenes sin procesar se procesaron utilizando el software ImageJ (vXNUMX).

AFM

Se tomaron imágenes de las estructuras NanoRod en un disco de mica fijado con adhesivo epoxi al centro de un portaobjetos de microscopio y encerrado por un anillo de plástico unido al portaobjetos usando Reprorubber. Las nanoestructuras se diluyeron a 1 nM en tampón TE-Mg (base Tris 5 mM, EDTA 1 mM, MgCl 10 mM).₂, pH 8.0) y se pipetearon 10 µl sobre mica recién escindida. Después de 30 s, 4 l de NiSO 5 mM₄ Se añadió y se incubó durante 4.5 min más. Luego se enjuagó la superficie con 1.0 ml de tampón TE-Mg filtrado de 0.1 µm, después de lo cual se añadieron 1.5 ml de tampón TE-Mg filtrado al disco de mica para obtener imágenes. Las imágenes se realizaron en líquido utilizando un microscopio de fuerza atómica NanoWizard 3 Ultra de JPK Instruments con un voladizo Bruker AC40 en modo CA.

PINTURA DE ADN de nanoestructuras NanoRod de insulina

Los pocillos de fondo de vidrio µ-Slide 18 Well (ibidi) se limpiaron con isopropanol y se secaron con N₂. Los pocillos se incubaron con 1 mg ml^-1 Albúmina sérica bovina con biotina (Thermo Fisher) en tampón A (Tris-HCl 10 mM, NaCl 100 mM y Tween 0.05 al 20 % (v/v) a pH 8.0) durante 5 min a temperatura ambiente, se lavó tres veces con tampón A y se incubó con 0.5 mg ml^-1 neutravidina (Thermo Fisher) en tampón A durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego, los pocillos se lavaron tres veces con tampón A seguido de tres lavados con tampón B (Tris-HCl 5 mM, MgCl 10 mM).₂, EDTA 1 mM y Tween 0.05 al 20% (v/v) a pH 8.0). Luego, NanoRods de 500 pM que incorporan cuatro cadenas de ADN marcadas con biotina (Datos ampliados Fig. 2a), con INS-DNA que contiene una secuencia de acoplamiento PAINT de 9 nucleótidos (DS1; Tabla complementaria 3), se añadió a cada pocillo durante 5 min. Los pocillos se lavaron tres veces con tampón B. Luego, 1 nM de cadena del generador de imágenes Atto-647N (IS1; Tabla complementaria 10) en tampón B suplementado con eliminadores de oxígeno (ácido protocatecuico (Sigma), protocatecuato 3,4-dioxigenasa (Sigma) y Trolox (Sigma)) a cada pocillo. Para PAINT de doble intercambio, tres secuencias de acoplamiento (DS2; Tabla complementaria 10) se agregaron en ambos extremos de los NanoRods. Las muestras se prepararon como se describió anteriormente, y los pocillos se lavaron diez veces con tampón B entre cada adquisición de imágenes. Cada adquisición de imágenes se realizó con una cadena de imágenes Atto-647N diferente (IS1 e IS2; Tabla complementaria 10). Se utilizó el software Micro-Manager para adquirir 9,000 cuadros con un cuadro de lectura de 10 MHz, exposición de 200 ms y sin ganancia de multiplicación de electrones (Nota complementaria y las Figs suplementarias. 2 y 3).

SPR

Se utilizó un instrumento Biacore T200 (Cytiva) para realizar los experimentos de SPR y los datos se adquirieron utilizando el software de control del sistema Biacore T200 v. 2.01. Se inmovilizó ECD-IR biotinilado (Nordic BioSite) en un sensor chip SA de estreptavidina (Cytiva). Se utilizó tampón HBS-P+ (Cytiva) como tampón de ejecución. Después de la inmovilización de ECD-IR, se introdujo un tiempo de estabilización de 15 minutos para alcanzar una línea base estable. Se inyectaron NR-1, NR-2, NR-4, NR-7, NR-15, NR-8 y NR-8dsDNA a una concentración de insulina de 11.4 nM en el tampón de ejecución. Se inyectaron insulina y ADN-INS a 55 nM, la concentración mínima para obtener una curva de unión que pudiera analizarse. Se inyectó NR como control negativo en una concentración igual a la concentración más alta de NanoRod utilizada en las inyecciones de insulina NanoRod (NR-1 = 11.4 nM). Alternativamente, se inyectaron NR-2, NR-4, NR-7 y NR-15 a una concentración de nanoestructura de 5.7 nM (Datos ampliados, Fig. 4e), y NR-7^K-PEG También se le inyectó una concentración de insulina de 50 nM (Datos ampliados, Fig. 9c). La inyección de cada muestra se realizó mediante una fase de asociación de 180 s y una fase de disociación de 300 s. La constante de equilibrio de disociación (K_D), tasa de asociación constante (k_on) y tasa de disociación constante (k_off) se determinaron utilizando el software BIAevaluación 3.0. El t_1/2 Los valores que definen el tiempo de residencia se determinaron mediante la fórmula ln2/k_off. Para comparar la unión de las estructuras NR-7 entre IR e IGF1R, se inmovilizaron las proteínas ECD-IR y ECD-IGF1R (Nordic BioSite) en dos celdas de flujo diferentes de chips sensores CM5 mediante reacciones de acoplamiento de aminas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La unión de la insulina y el INS-ADN se probó inyectando diferentes concentraciones de insulina (6.2, 18.5, 55.6, 166.7 y 500.0 nM) en el tampón de ejecución (HBS-P+) en el modo cinético de ciclo único, utilizando una fase de asociación de 140 s y una fase de disociación de 300 s. La unión de NR-7 se probó inyectando una única concentración de estructura (11.4 nM de insulina) usando una fase de asociación de 180 s y una fase de disociación de 300 s.

gel de coomassie

Aquí se resuspendieron 0.5 µg de ECD-IR recombinante (Nordic BioSite) en tampón de muestra Laemmli (Bio-Rad). Para las condiciones reductoras, se añadió 2-mercaptoetanol hasta una concentración final del 2.5%. Las muestras se desnaturalizaron a 80 °C durante 10 minutos, se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio y se tiñeron con tinción de proteína segura GelCode Blue (Thermo Fisher Scientific).

Ensayo de cambio de gel

Se incubaron NanoRods (NR y NR-7) a 20 nM con dominio extracelular recombinante 300 nM de IR humano (Nordic BioSite) o con PBS durante 30 min a 4 °C. Luego, las muestras se procesaron en un gel de agarosa al 2 % y se tiñeron con SYBR Safe.

Inmunotransferencia

Las células se lavaron con PBS, se lisaron en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (Sigma-Aldrich) suplementado con un cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa (Thermo Fisher Scientific) y se incubaron en hielo con agitación durante 30 minutos. El lisado se aclaró mediante centrifugación (20,000 ×g durante 20 min a 4 °C) y los lisados ​​de proteínas se cuantificaron utilizando el ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad). Los lisados ​​de proteínas se resuspendieron en el tampón de muestra Laemmli (Bio-Rad) que contenía 2.5% de 2-mercaptoetanol, se desnaturalizaron a 80 °C durante 10 minutos, se resolvieron mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno. Las membranas se incubaron durante 1 h en una solución de bloqueo (solución salina tamponada con Tris con 0.1 % de Tween 20 (TBST) y 5.0 % de leche en polvo descremada), seguido de una incubación durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra fosfo-IR beta/IGF1R. beta (CST 3024, 1:1,000), fosfo-AKT-S473 (CST 4058, 1:1,000) o GAPDH (Invitrogen PA1-987, 1:5,000). Después de tres lavados con TBST, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (Invitrogen, 31460, 1:5,000) durante 1 h a temperatura ambiente. La detección de peroxidasa de rábano picante se realizó mediante el sustrato quimioluminiscente Immobilon Forte en un sistema de imágenes ChemiDoc (Bio-Rad). La densiometría de banda se realizó utilizando el software ImageJ.

Citometría de flujo

Se prepararon adipocitos diferenciados, privados de suero, como se describió anteriormente. Posteriormente, los adipocitos se lavaron dos veces con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) y se disociaron en solución de colagenasa D (1.5 U ml^-1 colagenasa D (Roche) y CaCl 10 mM₂ en HBSS) durante 20 min a 37 °C. Las células se resuspendieron en HBSS, se filtraron a través de un filtro celular equilibrado con HBSS de 35 µm (BD Biosciences), se sedimentaron a 300 ×g durante 5 min y se resuspendió en un tampón de tinción (1x PBS y albúmina sérica bovina al 1%). Las células muertas se marcaron con el kit de tinción de células muertas amarillas fijables LIVE/DEAD (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y, posteriormente, la suspensión celular se sedimentó a 300 ×g durante 5 min y se resuspendió en el tampón de tinción. Aquí se incubaron aproximadamente 100,000 células con estructuras NanoRod marcadas con ATTO-10 647 nM en un volumen final de 100 µl durante 10 minutos a 37 °C. Las células incubadas sin las estructuras NanoRod se utilizaron como control sin tratar. Luego, las células se lavaron dos veces con el tampón de tinción mediante centrifugación a 300 ×g durante 5 min. Las mediciones de citometría de flujo se realizaron en un BD FACSCANTO II con el software BD FACSDIVA v. 9.0 (BD Biosciences). Las células de adipocitos vivos se identificaron inicialmente mediante la activación de células en FSC-A frente a AmCyan-A, seguido de la activación de FSC-A frente a FSC-H para detectar singletes. Los datos adquiridos se analizaron utilizando el software FlowJo 10.7.1 (BD Biosciences). La media geométrica de la intensidad de la fluorescencia después de la normalización con respecto al control no tratado se utilizó para definir el grado de etiquetado celular mediante los NanoRods.

Preparación y secuenciación de la biblioteca RNA-seq.

El ARN total se aisló de adipocitos diferenciados usando el kit Quick-RNA Microprep Plus (Zymo Research) y se usaron 500 ng de ARN purificado para la preparación de la biblioteca mRNA-seq usando el kit TruSeq RNA Library Prep v2 de acuerdo con el protocolo de muestra baja del fabricante. La cuantificación de la biblioteca se realizó utilizando el sistema QuantiFluor dsDNA (Promega) de acuerdo con el protocolo de placas multipocillos del fabricante en un lector de microplacas multimodo Varioskan LUX (Thermo Fisher). El tamaño y la calidad de la biblioteca se evaluaron utilizando Bioanalyser 2100 y High Sensitivity DNA Kit (Agilent). Las bibliotecas se desnaturalizaron y diluyeron utilizando el protocolo de normalización estándar de NextSeq (Illumina) y la secuenciación se realizó mediante lecturas de un solo extremo (1 × 75 pb) con el kit de alto rendimiento NextSeq 500/550 v. 2.5 (75 ciclos) en una plataforma NextSeq 550 ( Ilumina).

Cuantificación de RNA-seq, análisis DEG y GSEA.

Las lecturas de secuenciación se mapearon con un transcriptoma de referencia de Mus musculus secuencias de transcripción codificantes de proteínas (liberación M29, GRCm39; https://www.gencodegenes.org/mouse/) y cuantificado utilizando Salmon 1.7.0 (ref. ³³). Las tablas de recuento se generaron utilizando el paquete tximport.³⁴ y las listas de DEG se obtuvieron usando el paquete DESeq2 (v. 1.34.0)³⁵, donde solo genes con ajuste P valores iguales o inferiores a 0.001 y un log₂Se consideró el límite de cambio de veces en ±0.58 para análisis adicionales. Los mapas de calor y los gráficos UpSet se generaron utilizando ComplexHeatmap (v. 2.10.0)³⁶. GSEA para procesos biológicos con términos de ontología genética y rutas KEGG se realizó utilizando una lista clasificada de genes como entrada a clusterProfiler (v. 4.2.2)³⁷ y una importancia de la tasa de descubrimiento falso ajustada P valores inferiores a 0.10 y 0.05, respectivamente.

Microinyecciones de pez cebra y cuantificación de glucosa libre.

NanoRod y NanoRods de insulina se mezclaron con oligolisina-PEG (K₁₀-CLAVIJA_5K, Alamanda Polymers) en una proporción de 1:1 entre las aminas de lisinas en K₁₀-CLAVIJA_5K y los fosfatos en el ADN³⁰, y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de una microinyección de 2 nl de la muestra en cada larva de pez cebra. Las muestras para inyección se prepararon a una concentración final de 100 nM de estructuras para las muestras de NanoRod recubiertas y a una concentración final de 100 nM de insulina para las muestras de NanoRod de insulina recubiertas (correspondientes a 100.0 y 14.3 nM de NanoRods para NR-1^K-PEG y NR-7^K-PEG, respectivamente). Se ha demostrado que la inyección de 1 nl de insulina humana a una concentración de 100 nM en larvas de pez cebra induce una disminución en los niveles de glucosa libre y cambios transcripcionales consistentes con la señalización de la insulina.³⁸. Por lo tanto, inyectamos 2 nl de una concentración de insulina de 100 nM en nuestros ensayos para evaluar los efectos mediados por la insulina sobre los niveles de glucosa libre. Dado que el volumen sanguíneo total de un pez cebra de 2 dpf es de 60 a 89 nl (ref. ³⁹), la concentración estimada de la insulina inyectada en nuestros ensayos sería de alrededor de 2 a 3 nM. En estos ensayos, también estábamos limitados en la cantidad de muestra inyectada, con niveles de inyección más altos (3 y 4 nl) que resultaban en una pobre supervivencia de las larvas.

El mantenimiento y cruce del pez cebra (D. rerio) las líneas se realizaron de conformidad con la legislación sueca sobre bienestar animal aprobada por el Stockholms djurförsöksetiska nämnd. Dado que para los experimentos de ablación de células β y ensayo de glucosa libre solo se utilizaron animales menores de 5 días, no se requirió ningún permiso ético según 2010/63/UE. Las líneas transgénicas de pez cebra utilizadas han sido descritas previamente, a saber, Tg(ins:PPC–NTR)^s892 (árbitro. ²⁷) y Tg(ins:Kaede)^s949 (árbitro. ²⁸).

La ablación de células β se realizó en bebés de dos días. Tg(ins:PPC–NTR) y Tg(ins:PPC–NTR);Tg(ins:Kaede) embriones mediante tratamiento con MTZ 10 mM (Sigma-Aldrich) diluido en DMSO al 1% (VWR) en una solución de agua de huevo (E3) suplementada con 0.2-fenil-1-tiourea 2 mM (PTU, Acros Organics) durante 24 h. Después de la ablación de células β, tres días de edad Tg(ins:PPC–NTR) se anestesiaron larvas (72 hpf) en tricaína al 0.01% y se les inyectaron 2 nl de 1x PBS, insulina no modificada o NanoRod/NanoRods de insulina recubiertos en la vena cardinal común (conducto de Cuvier).⁴⁰. Se añadió rojo de fenol (Sigma-Aldrich) hasta una concentración final del 0.1 % a las muestras de PBS, insulina o NanoRod de insulina recubierta para ayudar en la visualización del proceso de microinyección y la determinación de las larvas inyectadas con éxito. Las larvas de pez cebra fueron asignadas aleatoriamente a los grupos de tratamiento. Los niveles de glucosa libre se midieron como se describe en otra parte.⁴¹ utilizando un kit enzimático basado en fluorescencia (BioVision). Se utilizaron grupos de tres a seis larvas inyectadas por condición/réplica.

Imágenes confocales

Tg(ins:PPC–NTR);Tg(ins:Kaede) -las larvas sometidas a ablación se recogieron 24 h después del tratamiento de ablación, se anestesiaron y se inyectaron siguiendo el protocolo establecido anteriormente y se fijaron en una solución de paraformaldehído al 4% antes de analizar el número de células β mediante imágenes confocales. Las imágenes confocales se adquirieron con un microscopio Leica TCS SP8 y el software LAS X (v. 3.5.5.19976). Los islotes pancreáticos primarios del grupo sometido a ablación de células β Tg(ins:PPC–NTR);Tg(ins:Kaede) las larvas se escanearon con un objetivo de inmersión en agua ×40 y el z Las pilas se analizaron utilizando el software Fiji (v1.53). Todas las imágenes mostradas se adquirieron del mismo experimento y sus valores de contraste se ajustaron con fines de visualización. La cuantificación de células β se realizó en imágenes originales no modificadas.

análisis estadístico

No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar los tamaños de muestra, pero los tamaños de muestra fueron similares a los informados en publicaciones anteriores.^28,38,42. Se asignaron aleatoriamente muestras de cultivos celulares y animales a los grupos de control y tratamiento. La recopilación y el análisis de datos no se realizaron a ciegas con respecto a las condiciones de los experimentos. Los puntos de datos individuales se trazan para la mayoría de los gráficos. Tamaño de la muestra (n) del número de repeticiones biológicas experimentales y de los métodos estadísticos utilizados se indican en las leyendas de las figuras correspondientes. Se probaron los conjuntos de datos para determinar la distribución gaussiana seguida de la prueba estadística adecuada. El análisis estadístico y la representación gráfica de los datos se procesaron con GraphPad Prism 9.4.0. Se realizó la prueba de Mann-Whitney de dos colas para comparar las propiedades del grupo entre las células de control y las tratadas con insulina. Para las cuantificaciones de transferencia Western, se llevó a cabo un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Para la cuantificación de células β se realizó la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. El análisis de los valores de glucosa libre se realizó mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey.

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de la cartera de naturaleza vinculado a este artículo.

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01507-y