Materiales

2-etil-1-hexanol (98 %, Sigma); 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida HCl (Carbosynth); 1,6-diaminohexano (98%, Sigma); PEG-bis-(N-succinimidilsuccinato) (M_w = 2,000, Sigma); éster DyLight 405 NHS (ThermoFisher); éster FITC NHS (ThermoFisher); BSA (fracción de choque térmico, pH 7.0, ≥98 %; Sigma); estreptavidina de Streptomyces avidinii (Sigma); Tamavidin 2-HOT, recombinante (Wako Chemicals); amina Dynabeads M-270 (Invitrogen); ácido carboxílico Dynabeads MyOne (Invitrogen); 1 MgCl₂ (Invitrogen); Tris 1 M pH 8.0 libre de RNasa (Invitrogen); NaCl 5 M (Invitrogen); EvaGreen (biotio); kit de PCR KAPA HiFi HotStart (Roche); kit de purificación y emulsión de ADN de micelula (EURx); aceite antievaporación ibidi (ibidi); solución de acrilamida al 30% (19:1 monómero:bis) (Bio-Rad); y SYBR Gold (ThermoFisher) se usaron tal como se recibieron. Todos los demás productos químicos utilizados se compraron a Sigma. Las enzimas se adquirieron de New England Biolabs, a menos que se indique lo contrario.

Sintetizando BSA-NH₂–Nanoconjugados de PNIPAm

BSA cationizado (BSA-NH₂) se sintetizó de acuerdo con un método previamente informado³⁶. Normalmente, una solución de diaminohexano (1.5 g, 12.9 mmol en 10 ml de agua Milli-Q) se ajustó a pH 6.5 utilizando HCl 5 M y se añadió gota a gota a una solución agitada de BSA (200 mg, 3 μmol en 10 ml de agua Milli-Q). agua). La reacción de acoplamiento se inició añadiendo 100 mg de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida HCl inmediatamente y luego otros 50 mg después de 5 h. Si era necesario, el valor de pH se reajustó a 6.5 ​​y la solución se agitó durante otras 6 h y luego se centrifugó para eliminar cualquier precipitado. El sobrenadante se dializó (tubo de diálisis Medicell; límite de peso molecular (MWCO) de 12 a 14 kDa) durante la noche contra agua Milli-Q y se secó por congelación.

PNIPAm activado por mercaptotiazolina con protección terminal (M_n = 13,284 g mol^-1, 4 mg en 5 ml de agua Milli-Q) se sintetizó de acuerdo con el método informado anteriormente¹ y añadido a una solución agitada de BSA-NH₂ (10 mg en 5 ml de tampón PBS a pH 8.0). El peso molecular y la polidispersidad de PNIPAm activado se determinaron mediante cromatografía de permeación en gel (Fig. 20). La solución se agitó durante 10 hy luego se purificó usando un filtro centrífugo (Millipore, Amicon Ultra; MWCO, 50 kDA) y se secó por congelación. Después de la liofilización, el BSA-NH obtenido₂–El conjugado de PNIPAm se caracterizó mediante desorción/ionización láser asistida por matriz, espectrometría de masas y potenciometría zeta (Fig. 20).

BSA-NH marcado con FITC y DyLight-405₂–Los conjugados de PNIPAm se prepararon usando el mismo método, excepto que se usó BSA marcada como material de partida.

Etiquetado de BSA con tintes fluorescentes

BSA se marcó con FITC de la siguiente manera: se disolvieron 200 mg de BSA en 10 ml de tampón de carbonato de sodio 50 mM (pH 9). Luego, se disolvieron 2.36 mg de FITC en 590 μl de DMSO y se añadieron a la solución de BSA agitada. La solución resultante se agitó durante 5 h, se purificó mediante diálisis (tubos de diálisis Medicell; MWCO, 12-14 kDa) durante la noche contra agua Milli-Q y se secó por congelación. BSA se marcó con DyLight 405 de la siguiente manera: se disolvieron 30 mg de BSA en 6 ml de tampón de carbonato de sodio 50 mM (pH 9). Luego, se disolvió 1 mg de éster DyLight 405 NHS en 100 μl de DMF y se agregó a la solución agitada de BSA. La solución se agitó durante 2 h, se purificó mediante diálisis (tubos de diálisis Medicell; MWCO, 12-14 kDa) durante la noche frente a agua Milli-Q y se secó por congelación. Usando espectrofotometría ultravioleta-visible, determinamos el número promedio de colorantes por proteína. Para el etiquetado de DyLight 405, medimos, en promedio, 1.4 colorantes por molécula de BSA. Para el etiquetado FITC, medimos 1.3 colorantes por molécula de BSA.

Preparación de proteinosomas que contienen Tamavidin 2-HOT

Se prepararon proteinosomas que contenían Tamavidin 2-HOT y partículas magnéticas (amina Dynabeads M-270) de manera similar a³⁷ descripciones de proteinosomas que contienen estreptavidina. Los proteinosomas utilizados para los experimentos (Fig. 1c-e) no contenía partículas magnéticas. Nanoconjugados BSA-PNIPAm (6 mg ml^-1 total, 1 mg ml^-1 de los cuales estaba marcado con fluorescencia) se mezclaron con 4 µM Tamavidin 2-HOT y 4 mg ml^-1 Dynabeads en 7.5 µl de fase acuosa; 0.6 mg de PEG-bis(N-succinimidilsuccinato) (M_w = 2,000) se disolvió en 7.5 µl de tampón de carbonato de sodio 50 mM (pH 9) y se añadió a la mezcla, que luego se agitó brevemente. A continuación, se añadieron 300 µl de 2-etil-1-hexanol, seguido de agitación vorticial para producir la emulsión de Pickering. La mezcla resultante se dejó a temperatura ambiente durante 2 h para entrecruzar los nanoconjugados. La fase oleosa se eliminó pipeteando la capa oleosa superior y se añadieron 300 µl de etanol al 70 % para resuspender el sedimento. Luego, la dispersión se dializó secuencialmente (tubo de diálisis Medicell; MWCO, 12-14 kDa) frente a etanol al 70 % y al 50 % durante 2 h cada uno y finalmente durante la noche frente a agua Milli-Q para producir proteinosomas en agua. Luego, los proteinosomas se almacenaron a 4 °C para su uso posterior.

Síntesis de oligonucleótidos de ADN

Excepto los archivos de codificación de ADN de Twist Bioscience, todos los oligonucleótidos de ADN se compraron de Integrated DNA Technologies. Se compraron oligonucleótidos modificados que se purificaron con cromatografía líquida de alta resolución y se compraron oligonucleótidos no modificados desalinizados. Las soluciones madre (100 y 10 μM) se prepararon utilizando tampón TE libre de nucleasas (Tris 10 mM, EDTA 0.1 mM, pH 7.5; Integrated DNA Technologies) y se almacenaron a -30 °C. La codificación de ADN para los archivos se ordenó a Twist Bioscience. Estos archivos se amplificaron individualmente mediante PCR en una reacción de 20 µl que contenía un grupo de ADN de 1 ng, cebadores directo e inverso de 0.5 µM y polimerasa KAPA HiFi HotStart. El protocolo de amplificación fue el siguiente: desnaturalización a 95 °C por 3 min, desnaturalización a 98 °C por 20 s, hibridación a 65 °C por 15 s y extensión a 72 °C por 15 s. Los segundos pasos de desnaturalización, recocido y extensión se repitieron de 8 a 10 veces, seguidos de una extensión final a 72 °C durante 30 s antes de enfriarse a 4 °C. A continuación, los amplicones resultantes se purificaron utilizando el kit de extracción por PCR de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante. Los archivos que se obtuvieron de esta manera se mezclaron en proporciones iguales en 10 ng y se enviaron a temperatura ambiente desde Seattle a Eindhoven. Estas plantillas luego se usaron de manera similar a los oligonucleótidos ssDNA ordenados de Integrated DNA Technologies.

Preparación de dsDNA con biotina de fluoróforos

Los complejos de doble cadena que consisten en cadenas de menos de 100 nt se formaron mediante recocido térmico. Las hebras biotiniladas se mezclaron con hebras no biotiniladas a 12 y 10 µM y se calentaron a 95 °C en un termociclador durante 3 min. Posteriormente, las muestras se enfriaron a temperatura ambiente a una velocidad de -0.5 °C min^-1.

En este caso, se prepararon cadenas de dsDNA de más de 100 pb, con modificaciones fluorescentes y/o de biotina, a partir de plantillas ultraméricas de cadena sencilla o archivos de dsDNA y cebadores modificados mediante PCR, ya que estas construcciones no se podían ordenar directamente. Normalmente, las reacciones se realizaron a escala de 100 µl utilizando 5 µl (1 nM) de plantilla diluida, cebadores (0.5 µM cada uno) y polimerasa KAPA HiFi HotStart. El protocolo de amplificación fue el siguiente: desnaturalización a 95 °C por 3 min, desnaturalización a 98 °C por 20 s, hibridación a 65 °C por 15 s y extensión a 72 °C por 15 s. Los segundos pasos de desnaturalización, recocido y extensión se repitieron 16 veces, seguidos de una extensión final a 72 °C durante 30 s antes de enfriar a 4 °C. A continuación, los amplicones resultantes se purificaron utilizando el kit de extracción por PCR de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante.

Localización de ADN en proteinosomas

El ADN marcado con biotina se localizó inicialmente en Tris 10.0 mM (pH 8.0) con MgCl 11.5 mM₂ y Tween 0.1 al 20 % vol/vol. Típicamente, se añadieron 10 µl de solución que contenía proteinosoma a 5 µl de solución tampón 4x y 5 µl de ADN a localizar. La mezcla se mantuvo a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, 500 µl de tampón de lavado compuesto por Tris 10.0 mM (pH 8.0), NaCl 1 M, MgCl 11.5 mM₂ y se añadió 0.1% vol/vol de Tween 20, se dejó a 4°C durante la noche y se retiró al día siguiente. Los pasos de lavado secundarios se realizaron de manera similar a los primeros pasos, excepto que no se usó un paso durante la noche. En su lugar, los proteinosomas se separaron de la solución colocando la mezcla en una gradilla de separación magnética (DynaMag, Invitrogen) durante 3 min, después de lo cual se eliminó el sobrenadante con una pipeta.

Pruebas de estabilidad de localización inicial

Los proteinosomas que contenían ADN localizado se calentaron a 95 °C en una solución de 10 µl utilizando un termociclador MiniPCR durante al menos 5 min. Después de enfriar a temperatura ambiente, se colocó una gota de 2 µl sobre un cubreobjetos de microscopía de vidrio y se tomaron micrografías confocales.

Microscopía de fluorescencia dependiente de la temperatura

Los datos de fluorescencia se adquirieron utilizando un microscopio de barrido láser confocal (Leica SP8) equipado con láseres de estado sólido (405 nm para DyLight 405, 552 nm para Alexa 546 y 638 nm para Cy5) y un detector híbrido en el modo de conteo de fotones. Las mediciones de lapso de tiempo se realizaron con una apertura numérica de ×10/0.40 (campo de visión, 1.55 × 1.55 mm²; espesor de corte, 7 μm) a una resolución de 512 × 512 píxeles. Los datos de microscopía de barrido láser confocal de alta temperatura se obtuvieron utilizando un sistema de microcalentamiento VAHEAT (interherencia) con sustratos SmS-r. Se pipeteó una solución de 50 µl de proteinosomas cargados con ADN sobre la celda de muestra y se cubrió con 150 µl de aceite antievaporación de ibidi para evitar la evaporación. Los experimentos de difusión a temperatura ambiente se realizaron en nuestro previamente³⁷ matriz de captura microfluídica descrita. El procesamiento de datos se realizó utilizando un código Python personalizado similar al que hemos descrito anteriormente.³⁷.

Estadística

Todos los resultados que informan valores estadísticos se obtuvieron de triplicados independientes. El análisis se realizó utilizando la biblioteca SciPy de Python (Python 3.6.5, SciPy versión 1.1.0). Bilateral de Welch t-test se utilizó para comparar dos poblaciones. La significancia estadística entre más de dos muestras se determinó usando un análisis de varianza de una vía, seguido de un análisis post-hoc usando la prueba de comparación múltiple de Tukey. Solo valores de p < 0.05 se consideraron estadísticamente significativos.

SDA

El SDA de ADN localizado en proteinosomas se realizó mediante un protocolo adaptado de otro trabajo⁴⁶. La mezcla de reacción consistió en tampón 1 NEB 2x, cebador 0.5 µM, dNTP 250.0 µM cada uno, 0.125 U µl^-1 Fragmento Klenow (Exo-), 0.250 U µl^-1 Nt.BspQI, 0.2 mg ml^-1 BSA, proteína del gen 4 T4 32 µM y EvaGreen 1x. El volumen de reacción fue de 25 µl, 2 µl de los cuales consistieron en proteinosomas en un tampón (Tris 10.0 mM con MgCl 11.5 mM₂ y 0.1% vol/vol Tween 20). La reacción se mantuvo a 37 °C y se registró utilizando un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad). Para evitar la evaporación, la placa se selló con una pegatina transparente. La tasa de producción se determinó usando Python ajustando una función lineal a la intensidad de fluorescencia y el número de ciclo.

qPCR

La qPCR se realizó con el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad). El volumen de reacción total fue de 25 µl y consistió en KAPA HiFi HotStart, cebadores 0.5 µM, EvaGreen 1x y 2 µl de solución molde (ADN o proteinosomas). La desnaturalización inicial se fijó en 3 min a 95 °C, luego se realizaron 40 ciclos de desnaturalización a 98 °C por 20 s, recocido a 65 °C por 15 s y extensión a 72 °C por 15 s, seguido de un ciclo final. extensión a 72 °C durante 30 s antes de enfriar a 4 °C. Se midió la fluorescencia durante cada paso de recocido. Para evitar la evaporación, la placa se selló con un sellador de placas transparente. Se utilizó el software CFX Maestro versión 3.1.1517.0823 (Bio-Rad) para realizar la corrección de línea de base y calcular los ciclos de umbral (C_t).

Determinación de la formación de quimeras mediante análisis de gel PAGE

El volumen de reacción total fue de 25 µl y consistió en KAPA HiFi HotStart, cebadores 0.5 µM y 2.5 µl de solución de proteinosoma. El termociclado se realizó en un termociclador T1000 Touch (Bio-Rad). Después de la desnaturalización inicial de 3 min a 95 °C, se realizaron 20 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 20 s, recocido a 65 °C durante 15 s y extensión a 72 °C durante 15 s, seguido de una extensión final a 72 °C durante 30 s antes de enfriar a 4 °C. A las mezclas de PCR, se añadieron 5 µl de tinte de carga 6X (ThermoFisher) antes de cargar 12 µl en geles PAGE de TB-Mg al 10 %. Los geles se moldearon usando una solución de acrilamida al 30% (19:1 monómero:bis). Los tampones de corrida y gel fueron Tris 44.5 mM, ácido bórico 44.5 mM y MgCl 11.5 mM.₂. Los geles se corrieron durante 1 hora y 15 minutos a 150 V en un dispositivo de electroforesis de celda vertical Criterion (Bio-Rad) y se tiñeron durante 10 a 15 minutos usando SYBR Gold (ThermoFisher). Las imágenes se tomaron con un ImageQuant 400 Digital Imager (GE Healthcare). Las intensidades de imagen de las bandas de interés se determinaron utilizando el complemento de análisis de gel de ImageJ. En algunos geles, se observa una señal en la parte superior del gel, que atribuimos a complejos más grandes (como los complejos de polimerasa-ADN) presentes en las mezclas de reacción no purificadas. Estas señales no fueron consideradas en el análisis. El análisis estadístico se realizó utilizando Python.

PCR en emulsión

La PCR en emulsión de la biblioteca se realizó utilizando un kit de purificación y emulsión de ADN de Micellula. Una mezcla de reacción de 50 µl que contiene 25 µl de KAPA HiFi HotStart 2×, 50 ng de ADN molde, cebadores 4 µM (0.16 µM por par) y 1.25 mg ml^-1 Se utilizó BSA. La emulsión se formó agregando 300 µl de fase inorgánica premezclada y agitando en vortex a la máxima velocidad en un refrigerador a 4 °C durante 5 min, según las instrucciones del fabricante. La emulsión resultante se dividió en cuatro tubos y se termocicló de la siguiente manera: desnaturalización inicial por 3 min a 95 °C, 18 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 20 s, recocido a 65 °C por 15 s y extensión a 72 °C por Se realizaron 15 s, seguidos de una extensión final a 72 °C durante 30 s antes de enfriar a 4 °C. Las reacciones se combinaron, la emulsión se rompió y el ADN se purificó de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

A continuación, se cuantificaron las concentraciones relativas de los archivos individuales en el ADN purificado mediante qPCR.

Cuantificación de la concentración de PCR multiplex

El ADN localizado dentro de un grupo mixto de proteinosomas o a granel se amplificó en reacciones de 25 µl que constaban de 2 µl de ADN molde y cebadores (0.4 µM de cada par directo e inverso; Tabla complementaria 4 enumera las secuencias de los cebadores) utilizando la polimerasa KAPA HiFi HotStart. El termociclado se realizó en un termociclador C1000 Touch (Bio-Rad). Después de una desnaturalización inicial de 3 min a 95 °C, se realizaron 18 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 20 s, recocido a 65 °C durante 15 s y extensión a 72 °C durante 15 s, seguido de una extensión final a 72 °C durante 30 s antes de enfriar a 4 °C. Las mezclas de reacción se purificaron utilizando el kit de extracción Qiagen PCR siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se cuantificaron las concentraciones relativas de los archivos individuales en el ADN purificado mediante qPCR.

Preparación y secuenciación de bibliotecas

Las reacciones de PCR multiplex se realizaron en la Universidad Tecnológica de Eindhoven y se enviaron a temperatura ambiente a la Universidad de Washington. Al recibirlas, las muestras se validaron con un nanofotómetro Implen. Posteriormente, las muestras se prepararon para la secuenciación siguiendo el protocolo Illumina TruSeq Nano DNA Library Prep. Los extremos se hicieron romos con el tampón de reparación de extremos (ERP2) y luego se purificaron con perlas Beckman Coulter AMPure XP; un nucleótido 'A' se hibridó con el extremo 3' con una ligasa de cola A. La ligadura se realizó utilizando adaptadores de secuenciación de Illumina del kit de índices de CD de ADN TruSeq de Illumina, con cada muestra ligada a un índice de Illumina único. Finalmente, las muestras se limpiaron con perlas de purificación de muestras Illumina y se enriquecieron con una PCR de 12 ciclos. La longitud y la pureza del producto final se calificaron utilizando un bioanalizador QIAxcel. Luego, las muestras se cuantificaron individualmente mediante qPCR y se mezclaron para crear una biblioteca de igual masa.

Se preparó una biblioteca final para la secuenciación siguiendo la Guía de bibliotecas de desnaturalización y dilución de Illumina NextSeq. Las bibliotecas de secuenciación se cargaron en Illumina NextSeq a las 1.3 pM con un aumento de control del 20 % del genoma PhiX ligado.

Análisis de los datos de secuenciación de Illumina

La llamada base y la demultiplexación de las muestras secuenciadas se realizaron utilizando bcl2fastq. Los archivos FASTQ generados luego se alinearon con las secuencias de referencia usando Burrows–Wheeler Aligner⁵⁹. A continuación, se determinó la cobertura de cada secuencia utilizando SAMtools⁶⁰.

PCR de acceso repetido a granel

Se mezclaron tres limas en proporciones molares iguales hasta una concentración final de 0.5 nM. Se amplificaron tres alícuotas en reacciones de 100 µl que consistían en 5 µl de mezcla de plantilla y cebadores (0.5 µM) usando polimerasa KAPA HiFi HotStart. El protocolo de ciclo de PCR comprendió una desnaturalización inicial de 3 min a 95 °C, 10 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 20 s, recocido a 65 °C durante 15 s y extensión a 72 °C durante 15 s, seguido de una extensión final a 72 °C durante 30 s antes de enfriar a 4 °C. Se tomó una alícuota de 5 µl en la que luego se inactivaron los cebadores y los dNTP utilizando el kit de limpieza Exo-CIP Rapid PCR (NEB). De la mezcla resultante, se usaron 5 µl en la siguiente PCR como plantilla. Los 95 µl restantes de la reacción de PCR se almacenaron a -30 °C.

Acceso repetido mediante PCR en emulsión

Se mezclaron tres archivos en proporciones molares iguales y se realizó una PCR en emulsión de la biblioteca utilizando un kit de purificación y emulsión de ADN de Micellula. Una mezcla de reacción de 50 µl que contiene 25 µl de KAPA HiFi HotStart 2×, 50 ng de ADN molde, cebadores 0.5 µM y 1.25 mg ml^-1 BSA. La emulsión se formó agregando 300 µl de fase inorgánica premezclada y agitando en vortex a la máxima velocidad en un refrigerador a 4 °C durante 5 min, según las instrucciones del fabricante. La emulsión resultante se dividió en cuatro tubos y se termocicló de la siguiente manera: desnaturalización inicial por 3 min a 95 °C, 10 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 20 s, recocido a 65 °C por 15 s y extensión a 72 °C por Se realizaron 15 s, seguidos de una extensión final a 72 °C durante 30 s, antes de enfriar a 4 °C. Las reacciones se combinaron, la emulsión se rompió y el ADN se purificó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. De esta reacción purificada, se usó 1 µl en la siguiente reacción.

Después de cuatro rondas de acceso repetido, la mezcla purificada final se amplificó mediante PCR a granel para generar suficiente ADN para los experimentos de secuenciación. El protocolo para esta amplificación utilizó un volumen de reacción total de 25 µl y consistió en KAPA HiFi HotStart, cebadores 0.5 µM y 2 µl de mezcla de reacción purificada. El termociclado se realizó en un termociclador T1000 Touch (Bio-Rad). Después de la desnaturalización inicial de 3 min a 95 °C, se realizaron 20 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 20 s, recocido a 65 °C durante 15 s y extensión a 72 °C durante 15 s, seguido de una extensión final a 72 °C durante 30 s antes de enfriar a 4 °C. A continuación, la mezcla de reacción se purificó utilizando el kit de extracción Qiagen PCR siguiendo las instrucciones del fabricante.

PCR de acceso repetido en proteinosomas

Se localizaron tres archivos en poblaciones de proteinosomas individuales, se lavaron cinco veces y se mezclaron para crear el grupo final. Se amplificaron tres alícuotas en reacciones de 100 µl que consistían en 5 µl de la biblioteca de proteinosomas y cebadores (0.5 µM), utilizando la polimerasa KAPA HiFi HotStart. El protocolo de ciclo de PCR comprendió una desnaturalización inicial de 3 min a 95 °C, 10 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 20 s, recocido a 65 °C durante 15 s y extensión a 72 °C durante 15 s, seguido de una extensión final a 72 °C durante 30 s antes de enfriar a 4 °C. A continuación, las mezclas de reacción se colocaron en una rejilla de separación magnética (DynaMag, Invitrogen) durante 3 min para recuperar los proteinosomas. A continuación, se pipetearon 95 µl de la mezcla de reacción y se almacenaron a -30 °C. Los 5 µl restantes se lavaron tres veces usando 100 µl de tampón de lavado (Tris 10.0 mM (pH 8.0), NaCl 1 M, MgCl 11.5 mM₂ y 0.1% vol/vol Tween 20). Después de la recuperación magnética de los proteinosomas, se añadió una nueva mezcla de reacción a los 5 µl de solución de proteinosomas lavados para hacer un volumen final de 100 µl.

Preparación de proteinosomas que contienen Tamavidin 2-HOT para la clasificación

Debido a los tamaños más pequeños requeridos por la boquilla utilizada y la interferencia de las partículas magnéticas normalmente empleadas, los proteinosomas utilizados en el experimento de clasificación se prepararon de acuerdo con un protocolo ligeramente modificado. Se prepararon proteinosomas que contenían Tamavidin 2-HOT y partículas magnéticas (ácido carboxílico Dynabeads MyOne) utilizando métodos similares a los descritos anteriormente. Nanoconjugados BSA-PNIPAm (6.00 mg ml^-1 total, 1.00 mg ml^-1 de los cuales estaban marcados con fluorescencia) se mezclaron con 4 µM Tamavidin 2-HOT y 0.75 mg ml^-1 Dynabeads en 20 µl de fase acuosa total. A continuación, 0.6 mg de PEG-bis(N-succinimidilsuccinato) (M_w = 2,000) se disolvió en 40 µl de tampón de carbonato de sodio 50 mM (pH 9), se añadió a la mezcla y se agitó brevemente. Luego, se añadió 1 ml de 2-etil-1-hexanol y la mezcla se agitó posteriormente durante 30 min para producir la emulsión de Pickering. La mezcla resultante se dejó a temperatura ambiente durante 1.5 h para entrecruzar los nanoconjugados. La fase oleosa se eliminó pipeteando la capa oleosa superior y se añadieron 500 µl de etanol al 70 % para resuspender el sedimento. A continuación, la dispersión se dializó secuencialmente (tubos de diálisis Medicell; MWCO, 12-14 kDa) frente a etanol al 70 % y al 50 % durante 2 h cada uno y finalmente durante la noche frente a agua Milli-Q para producir proteinosomas en agua, antes de filtrar con un CellTrics de 30 µm. filtro celular (Sysmex). Verificamos el tamaño reducido de estos proteinosomas mediante microscopía confocal, cuyos resultados se muestran en la Fig. 2. Luego, los proteinosomas se almacenaron a 4 °C para su uso posterior.

Clasificación asistida por fluorescencia

Se usó un citómetro de flujo FACS Aria III (BD Biosciences), que opera a presión media-baja, para interrogar una mezcla de proteinosomas a través de una boquilla de 100 μm. Se prepararon proteinosomas marcados con DyLight-405 y FITC para FACS, y los archivos codificados en ADN se localizaron durante la noche en los proteinosomas. Estos proteinosomas se lavaron posteriormente con 500 µl de tampón de lavado (Tris 10.0 mM (pH 8.0), NaCl 1 M, MgCl 11.5 mM₂ y 0.1 % vol/vol de Tween 20) y se almacenó durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se extrajeron 500 µl de sobrenadante y se añadió ADN con código de barras fluorescente (marcado con biotina y Cy5 o Cy3) a los proteinosomas y se dejó localizar durante 15 min a temperatura ambiente. Después de la localización del código de barras, los proteinosomas se lavaron cuatro veces más mediante la adición de 500 µl de tampón de lavado, seguido de separación magnética y eliminación del sobrenadante. Las poblaciones de proteinosomas se mezclaron justo antes de la clasificación. Se registró un total de 1,000 a 2,000 eventos, a partir de los cuales se obtuvieron gráficos bidimensionales de la altura de la luz dispersada hacia adelante (FSC-H) versus el área de luz dispersada hacia adelante (FSC-A). La fluorescencia de FITC se interrogó usando un láser de 488 nm y un detector de 530/30 nm; Dylight 405 se excitó a 405 nm y se detectó a 460/55 nm. Cy5 (ex, 633; ​​em, 660/20). Cy3 (ex, 561; em, 582/15). La selección se realizó con el software BD FACSDiva (BD Biosciences) y consistió en la selección inicial en el gráfico FSC-H frente a FSC-A para seleccionar los proteinosomas contra el fondo y las perlas magnéticas no incorporadas. A partir de esta puerta inicial, definimos una puerta FITC alta y DyLight 405 alta, cada una de las cuales se dividió posteriormente en puertas Cy3 alta y Cy5 alta. Estas fueron las puertas finales utilizadas para clasificar los proteinosomas. Figura complementaria. 16 muestra la estrategia de activación detallada. La clasificación se realizó en tubos recubiertos con BSA y las poblaciones clasificadas se volvieron a analizar utilizando un citómetro de flujo BD Aria III, sin clasificar. Los gráficos finales se trazaron utilizando los paquetes flowCore y flowViz en R.

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01377-4