Síntesis y caracterización de péptidos, oligonucleótidos y conjugados péptido-oligonucleótido

Todos los péptidos y oligonucleótidos fueron sintetizados y purificados por HPLC por CPC Scientific e Integrated DNA Technologies (IDT), respectivamente. Los conjugados de péptido-oligonucleótido se generaron mediante química de clic sin cobre. Los conjugados se purificaron en un HPLC Agilent 1100. El análisis espectral de masas de los conjugados se realizó en un modelo Bruker MicroFlex de desorción/ionización láser asistida por matriz: espectrometría de tiempo de vuelo. Las secuencias de todas las moléculas utilizadas se enumeran en las tablas complementarias 1 y 3.

Ensayo de escisión fluorescente Cas12a

lbaCas12a (concentración final, 100 nM; New England Biolabs (NEB)) se incubó con 1x NEB Buffer 2.1, crRNA (250 nM; IDT) y activadores de ADN complementarios (4 nM, a menos que se describa específicamente, en solución o agregados en orina; IDT ) o muestras de orina recolectadas de animales de experimentación, en una reacción de 50 μl a 37 °C durante 30 min. Las reacciones se diluyeron por un factor de 4 en 1x NEB Buffer 2.1 y ssDNA T₁₀ Sustrato informador FQ (30 pmol; IDT) en un volumen de reacción de 60 l por pocillo y ejecutar por triplicado. lbaLa activación de Cas12a se detectó a 37 °C cada 2 min durante 3 h midiendo la fluorescencia con un lector de placas Tecan Infinite Pro M200 (λ_ex = 485nm, λ_em = 535nm). Las secuencias de todos los oligonucleótidos se enumeran en la Tabla complementaria 1. La fluorescencia para las condiciones de fondo (ya sea sin entrada de activador de ADN o sin condiciones de crRNA) se usó como controles negativos. La actividad de Cas12a ssDNasa se calculó a partir de la curva cinética generada por el lector de placas (fluorescencia de la sonda sintética frente al tiempo). La velocidad de reacción inicial (V₀) corresponde a la pendiente de la fase lineal de la curva cinética (8–10 puntos de tiempo iniciales). El análisis se realizó en Python v.3.9.

Ensayo de escisión Cas12a con lectura de flujo lateral

Las muestras se incubaron durante 30 min a 37 °C como en el ensayo de activación de Cas12a descrito anteriormente. Luego, las reacciones se diluyeron por un factor de 4 en 1 × NEB Buffer 2.1 y ssDNA T₁₀ Sustrato informador FAM-biotina (1 pmol; IDT) en un volumen de reacción de 100 µl e incubado a 37 °C durante 1–3 h. Las tiras de flujo lateral HybriDetect 1 se sumergieron en una solución (20 μl de muestra con 80 μl de tampón Milenia Hybridectect). La intensidad de las bandas se cuantificó en ImageJ v.1.49.

Caracterización de la concentración o longitud del activador de ADN para la actividad Cas12a ssDNase

Para identificar la longitud óptima para la detección con Cas12a, probamos longitudes de activador de ADN modificado y nativo truncado de 10 a 34 nt. Para determinar la robustez in vivo, se inyectaron diferentes longitudes de activadores de ADN modificados con fosforotioato a 1 nmol en ratones BALB/c, y se recolectaron muestras de orina 1 hora después de la inyección. Las muestras de orina se usaron como activadores de ADN en el ensayo de escisión fluorescente Cas12a. La actividad de Cas12a ssDNasa desencadenada por cada activador de ADN se normalizó a la del activador de ADN modificado de 24 unidades.

Detección de fluidos y análisis de datos.

Las reacciones de detección de Cas12 se realizaron en dos mezclas separadas, mezcla de ensayo y mezcla de muestra, para cargarlas en un circuito fluídico integrado (IFC) 96.96 de expresión génica microfluídica (Fluidigm): la mezcla de ensayo contenía 10 μM lbaCas12a (NEB), 1 reactivo de carga de ensayo (Fluidigm), 1 tampón NEB 2.1 y ARNcr 1 μM para un volumen total de 16 μl por reacción. La mezcla de muestras contenía 25.2 U RNasa inhibidor (NEB), 1 × NEBuffer 2.1, 1 × ROX Reference Dye (Invitrogen), 1 × GE Sample Loading Reagent (Fluidigm), 9 mM MgCl₂ y reportero de ADN fluorescente sintético apagado 500 nM (FAM-T₁₀–3IABkFQ, IDT) para un volumen total de 12.6 μl. A continuación, se cargaron una jeringa y 4 μl de mezclas de ensayo o muestra en sus ubicaciones respectivas en un IFC microfluídico GE 96.96 y se ejecutaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El IFC se cargó en Juno (Fluidigm) donde se ejecutó el script 'Load Mix'. Después de la carga adecuada de IFC, las imágenes se recolectaron durante un período de 3 h utilizando un protocolo personalizado en Biomark HD.

Para analizar los datos generados por el sistema Fluidigm, trazamos la fluorescencia restada de fondo normalizada por referencia para pares guía-objetivo. Para un par guía-objetivo (en un momento dado, t, y la concentración objetivo), primero calculamos el valor normalizado de referencia como (mediana (P_t - P₀) / (R_t - R₀)) dónde P_t es la señal de guía (FAM) en el punto de tiempo, P₀ es su medida de fondo antes de la reacción, R_t es la señal de referencia (ROX) en el punto de tiempo, R₀ es su medida de fondo, y la mediana se toma entre repeticiones. Los datos se visualizaron utilizando Python 3, R 4 y Prism 9.

Clonación y expresión de nanocuerpos recombinantes

Los fragmentos del gen gBlocks de doble cadena que codifican el nanocuerpo de interés con sitios de restricción NcoI y BlpI flanqueantes se ordenaron a IDT. Los fragmentos de genes se clonaron en el vector de expresión Novogen pET-28a(+) en los sitios de restricción NcoI y BlpI y se transformaron en SHuffle T7 competente. Escerichia coli (NEBRASKA). Las colonias bacterianas que codifican las inserciones genéticas correctas se confirmaron con la secuenciación de Sanger. Para la posterior producción de proteína recombinante, un cultivo secundario de 500 ml de SHuffle T7 competente E. coli. que codifica el gen del nanocuerpo de interés se cultivó en caldo LB suplementado con kanamicina a 37 °C a partir de un cultivo primario de 3 ml durante la noche hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD600) alcanzó aproximadamente 0.6–0.8. Luego se indujo la expresión de nanocuerpos con la adición de isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) (concentración final 0.4 mM). El cultivo se incubó a 27 °C durante 24 h. El sedimento bacteriano se lisó con el reactivo de extracción de proteína bacteriana completa B-PER (Thermo Fisher Scientific), luego se purificó mediante cromatografía de afinidad con metal inmovilizado estándar (IMAC) con agarosa Ni-NTA (Qiagen). El producto de nanocuerpos se confirmó mediante análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Las secuencias de nanocuerpos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 3.

Síntesis de un biomarcador de orina sintético codificado por ADN con un núcleo de nanocuerpo

El nanocuerpo (2 mg) se incubó a temperatura ambiente durante la noche en gel reductor de disulfuro TCEP inmovilizado Pierce (7.5 % v/v) (Thermo Fisher Scientific) para reducir selectivamente la cisteína C-terminal siguiendo un protocolo previamente establecido³⁷. La cisteína C-terminal reducida (1 equiv.) se hizo reaccionar con reticulante sulfo DBCO-maleimida (4 equiv.) (Click Chemistry Tools) en PBS (pH 6.5, EDTA 1 mM) a temperatura ambiente durante 6 h, después de lo cual el exceso de reticulante se eliminó con una columna de desalinización PD-10 desechable (GE Healthcare Bio-Sciences). El nanocuerpo funcionalizado con DBCO se refinó aún más mediante la cromatografía líquida de proteína rápida ÄKTA (GE Healthcare). La conjugación del indicador de ADN se realizó incubando un nanocuerpo funcionalizado con DBCO (1 equiv.) con un indicador de ADN funcionalizado con azida (1.1 equiv.) en PBS (pH 7.4) a temperatura ambiente durante 24 h. El indicador de ADN en exceso se eliminó mediante cromatografía de exclusión por tamaño. El producto se confirmó mediante análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se cuantificó con el kit de ensayo Quant-iT OliGreen ssDNA. Las secuencias de biomarcadores de orina sintética con código de barras de ADN utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 4.

Síntesis de biomarcadores de orina sintéticos codificados por ADN con núcleos poliméricos

Se disolvió PEG multivalente (40 kDa, ocho brazos) que contenía mangos reactivos con maleimida (tecnología JenKem) en tampón de fosfato 100 mM (pH 7.0) y se filtró (tamaño de poro, 0.2 μm). Después de la filtración, los conjugados de péptido-ADN terminados en cisteína se agregaron al PEG en un exceso molar de 2 veces y se hicieron reaccionar durante al menos 4 horas a temperatura ambiente. Las moléculas no conjugadas se separaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño con una columna Superdex 200 Increment 10/300 GL en un cromatógrafo de líquidos de proteína rápida ÄKTA (GE Healthcare). Los nanosensores purificados se concentraron mediante filtros giratorios (límite de peso molecular, 10 kDa; Millipore) y se cuantificaron con un kit de ensayo Quant-iT OliGreen ssDNA (Thermo Fisher Scientific). La fluorescencia se leyó en un lector de placas Tecan Infinite Pro M200 Quant-iT en λ_ex = 485nm, λ_em = 535 nm. Las partículas se almacenaron a 4 °C en PBS. Se utilizó dispersión de luz dinámica (Zeta Sizer Nanoseries, Malvern Instruments) para caracterizar el diámetro hidrodinámico de las nanopartículas. Las secuencias de biomarcadores de orina sintética con código de barras de ADN se enumeran en la Tabla complementaria 4.

Microscopía electrónica de transmisión criogénica

Los DNA-SUB basados ​​en núcleos poliméricos de 5 plex se agruparon y concentraron a 0.5 mg ml^-1 por concentración de ADN. Las muestras se cargaron en una rejilla de cobre recubierta con una película continua de carbono. A continuación, la rejilla se montó en un soporte criogénico de inclinación única Gatan 626 que se colocó en la columna del microscopio electrónico de transmisión. Las muestras se enfriaron con nitrógeno líquido y se mantuvieron frías durante la transferencia al microscopio (microscopio JEOL 2100 FEG ajustado a 200 kV; aumento, 10,000 60,000–2 2). Todas las imágenes se grabaron con una cámara de dispositivo acoplado por carga Gatan XNUMXkxXNUMXk UltraScan.

Análisis transcriptómico y proteómico

Los datos de RNA-Seq de adenocarcinoma de colon humano fueron generados por Cancer Genome Atlas Research Network (http://cancergenome.nih.gov). Los análisis de expresión diferencial se llevaron a cabo con DESeq2 1.10.1. Los datos proteómicos sobre la composición de la matriz extracelular en cánceres de colon humanos y tejidos de colon normales se obtuvieron mediante análisis de espectrometría de masas de los componentes de la matriz extracelular y están disponibles en Matrisome (http://matrisomeproject.mit.edu/).

Cultivo de células

La línea celular de ratón MC26-LucF (portadora de luciferasa de luciérnaga, de Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital) se cultivó en medio DMEM (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al 10% (v/v) (Gibco), suero bovino fetal al 1% ( v/v) penicilina/estreptomicina (CellGro) a 37 °C y en 5% CO₂. Las líneas celulares humanas PC-3 (ATCC CRL-1435) se cultivaron en RPMI1640 (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v) y penicilina/estreptomicina al 1 % (v/v). Se cultivaron células RWPE1 (ATCC CRL-11609) en medio libre de suero de queratinocitos (Gibco) suplementado con 2.5 µg de factor de crecimiento epidérmico humano recombinante y 25 mg de extracto de pituitaria bovina. Todas las líneas celulares dieron negativo para la contaminación por micoplasma.

Modelos animales

Todos los estudios con animales fueron aprobados por el comité de cuidado de animales del Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT) (protocolos MIT 0420-023-23 y 0220-010-23). Todos los experimentos se realizaron de conformidad con las directrices institucionales y nacionales y fueron supervisados ​​por el personal de la División de Medicina Comparada (DCM) del MIT.

Hembra BALB/c (BALB/cAnNTac, 6–8 semanas de edad; Taconic Biosciences), hembra NCr desnuda (CrTac:NCr-Foxn1^nu, 4–5 semanas de edad, Taconic Biosciences), y machos y hembras Kras^LSL-G12D/+;Trp53^{fl / fl} Se utilizaron ratones C57L/B6 (KP) (de 8 a 16 semanas de edad; obsequio de Tyler Jacks Laboratory, MIT) para los experimentos. Los ratones se mantuvieron en las instalaciones para animales del Koch Cancer Institute, con un ciclo de 12 h luz/12 h oscuridad (07:00–19:00), a ~18–23 °C y ~50 % de humedad. El agua esterilizada en autoclave y la dieta de comida estándar estuvieron disponibles en todo momento. Los ratones desnudos NCr se alojaron en habitaciones solo para inmunodeficientes, en jaulas esterilizadas en autoclave y ropa de cama de papel y se manipularon con técnicas estériles. El estado de salud de los ratones se comprobó semanalmente y diariamente cuando los tumores tenían >5 mm de diámetro. Los ratones se sacrificaron según los criterios de los veterinarios (por ejemplo, tamaño del tumor > 1 cm, malas condiciones corporales). Utilizamos un tamaño de muestra de al menos tres ratones por grupo. El tamaño del grupo es mayor o igual a cinco cuando se comparan los niveles de códigos de barras urinarios (dos caras). t-test, α fijado en 0.05). Los compañeros de camada del mismo sexo fueron asignados aleatoriamente a grupos experimentales y de control.

Para establecer los tumores pulmonares CRC, se inocularon ratones hembra BALB/c mediante inyección intravenosa con la línea celular MC26-Fluc que expresa luciferasa (100,000 células por ratón). La progresión del tumor se controló semanalmente utilizando un sistema de imágenes IVIS (PerkinElmer) y se cuantificó en Living Image (PerkinElmer). Para establecer el modelo de xenoinjerto de PCa, se inocularon ratones hembra desnudos NCr con líneas celulares PC-3 humanas (5 millones de células por flanco, 2 flancos por ratón) bajo anestesia con isoflurano. Las células se prepararon en matriz de membrana Corning Matrigel al 30 % (Thermo Fisher Scientific) y medios bajos en suero (Opti-MEM, Gibco). Los tumores se midieron semanalmente y los experimentos se realizaron una vez que los tumores de los flancos alcanzaron aproximadamente 5 mm de largo o ancho (~200 mm³) o 3 semanas después de la inoculación. El volumen del tumor se calculó mediante la medición con calibre de la longitud y la anchura del flanco; el cálculo del volumen siguió la ecuación f_x = (ancho² × longitud)/2, donde longitud es el segmento más largo.

Para inducir tumores pulmonares autóctonos, primero generamos Kras^LSL-G12D/+;Trp53^{fl / fl} Ratones C57L/B6 (KP)^42,43 en el que la activación de un alelo oncogénico de RASGUÑO es suficiente para iniciar el proceso de tumorigénesis, y la eliminación adicional o mutación puntual de Trp53 mejora sustancialmente la progresión del tumor, lo que conduce a un desarrollo más rápido de adenocarcinomas que tienen características de una enfermedad más avanzada. Los tumores de pulmón se iniciaron mediante la administración intratraqueal de 50 μl de adenovirus-SPC-Cre (2.5 × 10⁸ unidades formadoras de placas en Opti-MEM con cloruro de calcio 10 mM en ratones KP machos o hembras de entre 8 y 16 semanas) bajo anestesia con isoflurano. Las cohortes de control consistieron en ratones de la misma edad y sexo que también se sometieron a la administración intratraqueal de AdenoCre. Los ratones KP se mantuvieron sin intervención adicional para permitir el crecimiento del tumor hasta que se realizaron los experimentos.

Análisis del ensayo de escisión de Cas12a activado por código de barras de ADN urinario

Se inyectaron por vía intravenosa ssDNA (1 nmol), sensores PEG con código de barras de ADN de 5 plex (0.2 nmol cada uno, 1 nmol por concentración de código de barras de ADN en total) o sensores de nanocuerpos con código de barras de ADN (1 nmol por concentración de código de barras de ADN) en ratones experimentales. Las muestras de orina (100–200 μl por ratón) se recolectaron a las 12:00 todos los días, 1 h después de la inyección de ADN o del sensor, y se analizaron para determinar la activación de Cas12a para determinar la velocidad de reacción inicial (V₀). La normalización media se realizó en V₀ valores para tener en cuenta la variación de animal a animal en la concentración de orina. En el ensayo de escisión Cas12a que utilizó un indicador fluorescente, el y el eje representa la media normalizada V_{0_animales portadores de tumores}/media normalizada V_{0_controlar animales}. A continuación, se utilizó la misma muestra de orina para realizar el ensayo de escisión de Cas12a con lectura de LFA. Las tiras de papel resultantes se alinearon y escanearon simultáneamente. La intensidad de la banda se cuantificó con ImageJ v.1.49v.

Estudios de biodistribución y farmacocinética

Se usaron agentes marcados con tinte de infrarrojo cercano para minimizar la interferencia del fondo autofluorescente in vivo. A los ratones BALB/c se les inyectaron por vía intravenosa moléculas de ADN nativas o modificadas marcadas con Cy5 (1 nmol) y se recogieron muestras de orina a los 30 min y 1, 2, 3, 4 h después de la inyección. Los conjugados de nanocuerpo-ADN se acoplaron con éster de sulfo-cianina7 NHS (Lumiprobe, 2 colorantes equivalentes de proteína), se hicieron reaccionar durante la noche, se purificaron mediante filtración por rotación y se inyectaron por vía intravenosa en ratones desnudos portadores de tumores PC-3. Después de 24 h, los ratones fueron sacrificados y se realizó una necropsia para extirpar los tumores, los pulmones, el corazón, los riñones, el hígado y el bazo. La orina, la sangre y los órganos se escanearon utilizando los sistemas de imágenes IVIS y Odyssey CLx (LI-COR). La fluorescencia de órganos se cuantificó mediante ImageStudio en Odyssey CLx. La cinética circulatoria sanguínea se controló en ratones BALB/c mediante extracciones de sangre en serie a los 10 min, 30 min, 2 hy 3 h después de la inyección intravenosa de ADN marcado con Cy5 o PEG a 1 nmol de colorante por ratón. La sangre para las mediciones farmacocinéticas se recogió usando sangrados de la vena de la cola. La sangre se diluyó en PBS con EDTA 5 mM para evitar la coagulación, se centrifugó durante 5 min a 5,000g, y la concentración del indicador fluorescente se cuantificó en placas de 384 pocillos en relación con los estándares en el Odyssey CLx.

Estudios de histología, inmunohistoquímica e inmunofluorescencia

Los tejidos incluidos en parafina se conservaron en paraformaldehído al 4 % durante la noche y se almacenaron en etanol al 70 % antes de incluirlos en parafina. Los tejidos ultracongelados se conservaron en paraformaldehído al 2 % durante 2 h, se almacenaron en sacarosa al 30 % durante la noche y se congelaron en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) a -80 °C. Los pulmones ultracongelados se procesaron mediante inyección intratraqueal de OCT 50:50 en PBS inmediatamente después de sacrificar al animal por sobredosis de isoflurano. Los pulmones se congelaron lentamente con inclusión de OCT en un baño de isopentano/nitrógeno líquido. Las muestras se seccionaron en rodajas de 6 µm. Para los estudios de inmunohistoquímica, los portaobjetos se tiñeron con anticuerpos primarios de acuerdo con las instrucciones del fabricante, seguido de un polímero HRP de conejo sobre roedores utilizado tal como se recibió (Biocare Medical). Para los estudios de inmunofluorescencia, después de bloquear con suero de cabra al 5 %, BSA al 2 % y Triton X-0.1 al 100 % en PBS durante 1 h, las secciones se tiñeron con un anticuerpo primario en BSA al 1 % en PBS durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor se incubaron a 1 μg ml^-1 en BSA al 1% en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se sellaron con ProLong Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific) y se digitalizaron y analizaron con un escáner de portaobjetos 3D Histech P250 de alta capacidad (PerkinElmer). La toxicidad histológica fue evaluada por un patólogo veterinario que desconocía los grupos de tratamiento. Los anticuerpos primarios y las diluciones utilizadas se enumeran en la Tabla complementaria 5.

Extracción de ARN y reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real

Las células PC-3 y RWPE1 se cultivaron y recolectaron después de la tripsinización. Las muestras de tejido se recogieron mediante necropsia después de sacrificar a los ratones y se mantuvieron inmediatamente en reactivo de estabilización de ARN RNAlater (Qiagen). El ARN de sedimentos celulares o muestras de tejido criomolido se extrajo utilizando un kit RNeasy Mini (Qiagen). El ARN se transcribió inversamente en ADNc utilizando Bio-Rad iScript Reverse Transcription Supermix en un Bio-Rad iCycler. La amplificación cuantitativa de la reacción en cadena de la polimerasa del cDNA se midió después de mezclar con sondas de expresión génica Taqman y Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa se realizó en un termociclador Bio-Rad CFX96 Real Time System C1000.

Ensayos de escisión proteolítica de sustrato de proteasa recombinante y lisado tisular

Los sustratos de proteasa fluorogénica con fluorescencia (FAM) y extintor (CPQ2) fueron sintetizados por CPC Scientific. Las proteasas recombinantes se adquirieron de Enzo Life Sciences y R&D Systems. Las muestras de tejido se homogeneizaron en PBS y se centrifugaron a 4 °C durante 5 min a 6,000g. El sobrenadante se centrifugó adicionalmente a 14,000g durante 25 min a 4 °C. La concentración de proteínas se midió utilizando un kit de ensayo de proteínas Thermo Fisher BCA y se preparó a 2 mg ml^-1. Los ensayos se realizaron en placas de 384 pocillos por triplicado en tampón específico de enzima con péptidos (1 µM) y proteasas (40 nM para ensayo de proteasa recombinante)/lisados ​​celulares (0.33 mg ml^-1 para ensayo de lisado de tejidos) en 30 µl a 37 °C. La fluorescencia se midió a λ_ex = 485nm, λ_em = 535 nm en un lector de microplacas Tecan Infinite 200pro. Las enzimas y las condiciones del tampón se enumeran en la Tabla complementaria 6.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de PSA

Se recogieron aproximadamente 200 μl de sangre de la vena safena lateral de animales de experimentación y las células sanguíneas se sedimentaron inmediatamente por centrifugación a 14,000g durante 25 min a 4 °C. El plasma se almacenó a -80 °C antes de la cuantificación del PSA. Los niveles de PSA se midieron utilizando el kit PSA Quantikine ELISA de acuerdo con los protocolos del fabricante (R&D Systems).

Análisis estadístico y reproducibilidad

Los análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism 9. Los datos se mostraron como medias con sem. Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante comparaciones de grupos paramétricas y no paramétricas cuando correspondía con ajustes para pruebas de hipótesis múltiples. Específicamente, la normalidad de los grupos de datos se probó por primera vez mediante la prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov con la prueba de Dallal-Wilkinson-Lillie para P valor. Luego, los resultados se probaron para determinar la significación estadística mediante análisis de dos colas no apareados. t-test (paramétrico) para comparaciones de dos grupos y análisis de varianza para comparaciones de múltiples grupos. Los análisis no paramétricos se realizaron mediante la prueba de Mann-Whitney de dos colas no pareadas. Los tamaños de muestra y las pruebas estadísticas se especifican en las leyendas de las figuras. Todos los experimentos se repitieron de forma independiente al menos dos veces con resultados similares. Tenga en cuenta que los experimentos fueron repetidos y visualizados por dos investigadores independientes cuando se muestran los resultados de experimentos representativos (como micrografías histológicas o fluorescentes).

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de la cartera de naturaleza vinculado a este artículo.

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01372-9