Declaración de Ética

Todas las líneas de iPSC se derivaron previamente de fibroblastos de biopsia de piel, tras el consentimiento informado firmado, recopiladas bajo la aprobación ética otorgada por el Comité de Ética de Investigación de Gales del Sur (WA/12/0186) y el Comité de Ética de Investigación de South Central Berkshire (REC10/H0505/71). en el James Martin Stem Cell Facility de la Universidad de Oxford, bajo protocolos estandarizados. Todas las líneas iPSC se han publicado anteriormente (consulte a continuación la tabla complementaria 1).

cultura iPSC

Tres líneas de iPSC derivadas de tres pacientes de ELA diferentes que portaban un HRE en C9orf72 y como controles, una línea isogénica, previamente generada mediante la edición del genoma CRISPR/Cas9 mediante reparación dirigida por homología¹⁸y en este estudio se utilizaron cuatro líneas de control sanas de iPSC emparejadas por sexo y edad. Todas las líneas de iPSC se han publicado previamente y se han caracterizado exhaustivamente (para obtener detalles sobre la demografía y la caracterización, consulte la tabla complementaria 1). Las iPSC se cultivaron en mTeSR™1 (85850, StemCell Technologies) en Geltrex™ (A1413302, ThermoFisher) con cambios diarios de medio. Las células se pasaron usando EDTA (0.5 mM), se expandieron para producir reservas de células congeladas consistentes para el estudio (criopreservadas en 50 % de mTeSR™1, 30 % de suero bovino fetal de células madre embrionarias (16141002, Merck), 10 % de DMEM KnockOut™ ( 10829018, ThermoFisher), 10% DMSO (D2650, Merck)) con un máximo de 3 pases posteriores durante la experimentación, y dio negativo para micoplasma usando MycoAlert^TM Kit de detección de micoplasmas (Lonza).

Diferenciación de neuronas motoras derivadas de iPSC.

Las iPSC se diferenciaron de las MN mediante un protocolo publicado previamente³⁹. Brevemente, la inducción neuronal se realizó utilizando DMEM-F12/Neurobasal 50:50 suplementado con N2 (1X), B27 (1X), 2-mercaptoetanol (1X), antibiótico-antimicótico (1X, todo ThermoFisher), ácido ascórbico (0.5 μM). , Compuesto C (1 μM, ambos Merck) y Chir99021 (3 μM, R&D Systems). Después de dos días en cultivo, se agregaron ácido retinoico (1 μM, Merck) y agonista suavizado (500 nM, R&D Systems). Después de otros 2 días, se eliminaron el Compuesto C y Chir99021. El día in vitro (DIV) 18, las células se volvieron a sembrar en polietilenimina (PEI, 0.07 %, Merck) y Geltrex™ (ThermoFisher) o PDL (Sigma-Aldrich)/Laminin (R&D Systems)/Fibronectina (Corning) en medio suplementado adicionalmente con BDNF (10 ng/mL), GDNF (10 ng/mL), Laminin (0.5 μg/mL, todos ThermoFisher) y DAPT (10 μM, R&D Systems). Tres días después, el medio se cambió a medio de microglia como se describe a continuación, y los MN se cultivaron conjuntamente con microglia o se mantuvieron en monocultivo. Se realizaron cambios de medio medio cada 2 a 4 días.

Diferenciación de precursores de microglía derivados de iPSC.

Las iPSC se diferenciaron en precursores de macrófagos/microglia como se describió anteriormente^15,40. Brevemente, se indujo la formación de cuerpos embrioides (CE) sembrando iPSC en 800 pocillos de Aggrewell (STEMCELL Technologies) en mTeSR™1 suplementado con BMP4 (50 ng/ml), VEGF (50 ng/ml, ambos Peprotech) y SCF (20 ng/ml, Miltenyi Biotec). Después de cuatro a siete días con cambios diarios de medio de ¾, los EB se transfirieron a matraces T175 y se diferenciaron en X-VIVO15 (Lonza), suplementados con interleucina-3 (25 ng/ml, R&D Systems), MCS-F (100 ng/ml ), GlutaMAX (1X, ambos ThermoFisher) y 2-Mercaptoetanol (1X). Semanalmente se añadió medio fresco. Después de aproximadamente dos meses, se recolectaron los precursores recogiendo el sobrenadante, se pasaron a través de un filtro celular (40 μM, Falcon/Greiner) y se diferenciaron en microglía en monocultivo o cocultivo como se describe a continuación.

Diferenciación de microglía derivada de iPSC.

Los precursores de microglía se sembraron en PEI (0.07%) y Geltrex™ o PDL/Laminina/Fibronectina utilizando nuestro medio de microglía previamente caracterizado.¹⁷ compuesto por DMEM-F12 avanzado (ThermoFisher), GlutaMAX (1X), N2 (1X), antibiótico-antimicótico (1X), 2-mercaptoetanol (1X), interleucina-34 (100 ng/mL, Peprotech/BioLegend), BDNF ( 10 ng/ml), GDNF (10 ng/ml) y laminina (0.5 μg/ml). Las microglías se diferenciaron durante aproximadamente 14 días, con cambios de medio medio cada 2 a 4 días, y se recolectaron para extracción de ARN/proteína o se usaron para ensayos.

Cocultivo de neuronas motoras y microglía derivadas de iPSC.

Los cocultivos se generaron como se describió anteriormente usando la línea HC-2b (Tabla complementaria 1) para generar MN¹⁷. Brevemente, tres días después del nuevo recubrimiento final de MN diferenciadores (DIV21), se recolectaron precursores de microglía. Las MN se enjuagaron con PBS y se agregaron a cada pocillo precursores de microglia resuspendidos en medio de microglia en una proporción de 1:1 con las MN. Los cocultivos se mantuvieron durante al menos 14 días, con cambios de medio medio cada 2 a 4 días. En experimentos seleccionados, se evitó el contacto directo de los dos tipos de células colocando microglía en insertos de cultivo de tejidos (tamaño de poro de 0.4 µm, 83.3932.040, Sarstedt).

Cebado de microglía con tratamiento con inhibidores de LPS y MMP9.

Para los monocultivos de microglia, se aspiró todo el medio y se añadió LPS (100 ng/ml, L4391, Merck) en medio de microglia durante 48 h. Los pocillos de control recibieron únicamente medio de microglía nuevo. En condiciones seleccionadas, se realizaron tratamientos repetitivos con LPS los días 0, 2 y 4. Para los cocultivos, los tratamientos con LPS se iniciaron en DIV25 y se realizaron durante 10 días. La mitad del medio se aspiró y se reemplazó con LPS en medio de microglía (concentración final: 100 ng/ml), con cambios adicionales de la mitad del medio con medio de microglía que contenía LPS en DIV29 y 33. En experimentos adicionales, los tratamientos con LPS se iniciaron en DIV25 y realizado durante 20 días, con cambios de medio medio cada dos días. Se eliminaron BDNF y GDNF de los medios de cultivo para estos experimentos. Para inhibir MMP9, los cultivos se trataron concomitantemente con LPS (100 ng/ml) e inhibidor I de MMP9 (MMP9i, 3 μM, 444278, Merck) o DMSO en concentraciones iguales (0.3%) como control de vehículo.

Cebado de microglia con TNF/IL1B

Se aspiró todo el medio de monocultivos de microglia y se agregaron TNF (50 ng/ml) e IL1B (20 ng/ml, ambos Peprotech) en medio de microglia durante 48 h. Los pocillos de control recibieron únicamente medio de microglía nuevo.

Tratamiento de MN con rhMMP9 e inhibidor de MMP9.

Las MN se trataron con MMP9 humana activa recombinante (rhMMP9, 30 ng/ml, PF024-5UG, Merck) y MMP9i (3 μM, 444278, Merck) o DMSO en concentraciones iguales (0.3%) como control de vehículo. Los tratamientos se realizaron en DIV21 y DIV25, y la viabilidad de MN se determinó mediante ensayo MTS en DIV29.

Imágenes en vivo de fagocitosis y cuantificación.

Los monocultivos microgliales no estimulados y preparados con LPS (100 ng/ml durante 48 h) se tiñeron con Hoechst en Live Cell Imaging Solution (1:10,000, ThermoFisher) durante 10 min. Se agregaron pHrodo™ Red Zymosan Bioparticles™ (P35364, ThermoFisher) en solución de imágenes de células vivas (50 µg/mL) a cada pocillo y las imágenes se adquirieron después de 150 minutos utilizando un sistema de imágenes de células centrales EVOS™ XL (ThermoFisher) equipado con una lente de 10x. objetivo. En condiciones seleccionadas, las células se trataron adicionalmente con inhibidores de fagocitosis/degradación citocalasina D (10 μM, C2618, Merck), bafilomicina A1 (1 μM, 1334, R&D Systems) o DMSO (vehículo), con un pretratamiento de 1 h. La cuantificación se realizó automáticamente utilizando un análisis macro en Fiji y el área de partículas de fagocitosis por célula se obtuvo dividiendo el área de las partículas de fagocitosis internalizadas por el número de microglia Hoechst-positiva.

Electrofisiología de parche-clamp

La electrofisiología de parche-pinza de células completas se realizó como se describió anteriormente.¹⁷. Los MN de control sano en DIV 42–46 en cocultivo con control sano o microglía derivada de paciente C9orf72-ALS se mantuvieron en una solución extracelular que contenía NaCl 167 mM, KCl 2.4 mM, MgCl 1 mM.₂, glucosa 10 mM, HEPES 10 mM y CaCl 2 mM₂ se ajustó a un pH de 7.4 y 300 mOsm. Se produjeron electrodos con resistencias en la punta de entre 7 y 12 MΩ a partir de vidrio de borosilicato (0.86 mm de diámetro interior; 1.5 mm de diámetro exterior). Se añadió una solución intracelular al electrodo que contenía K-gluconato 140 mM, NaCl 6 mM, EGTA 1 mM, HEPES 10 mM, MgATP 4 mM, Na 0.5 mM.₃GTP, ajustado a pH 7.3 y 290 mOsm. La adquisición de datos se realizó utilizando un amplificador Multiclamp 700B, digidata 1550 A y el software ClampEx 6. Resistencia en serie (R_s) se mantuvo a <30 MΩ. Las corrientes de los canales dependientes de voltaje se midieron con una pinza de voltaje donde las neuronas fueron prepulsadas durante 250 ms con un pulso de -140 mV y se aplicó un voltaje en pasos de 10 mV de -70 mV a +70 mV. Los potenciales de acción inducidos (AP) se registraron en una pinza de corriente, las neuronas se mantuvieron a -70 mV y se aplicaron 15 pasos de corriente de 10 pA desde -10 pA a 130 pA. Las corrientes de los canales regulados por voltaje y las propiedades de los potenciales de acción inducidos (reobase, AP máximos, AP sobre reobase) se cuantificaron utilizando Clampfit 10.3 (paquete de software pCLAMP, Molecular Devices). Los AP máximos se cuantificaron determinando el número de AP en barrido con el tren más largo. La duración y amplitud de AP se cuantificaron en Matlab R2022a (MathWorks) utilizando el primer potencial de acción registrado de cada neurona.

grabaciones MEA

En total, se obtuvieron registros de actividad neuronal de 2 a 15 minutos para cocultivos en placas de matriz de electrodos múltiples (MEA) de 48 pocillos (M768-tMEA-48B, Axion BioSystems) utilizando el sistema Maestro (Axion Biosystems). El análisis se realizó utilizando el software AXIS v2.5.2 (Axion BioSystems) con SD> 5.5 como umbral de detección. La velocidad de disparo media por pocillo se calculó promediando todos los electrodos activos (>1 pico/min) por pocillo.

Aislamiento de ARN y RT-qPCR.

El ARN se extrajo utilizando un kit RNAeasy Mini Plus (Qiagen) y se transcribieron de forma inversa cantidades iguales de ARN (100 ng) a ADNc utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (ThermoFisher). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó con Fast SYBR™ Green Master Mix (ThermoFisher) utilizando un sistema de PCR LightCycler® 480 (Roche) y los cebadores (ThermoFisher) enumerados en la tabla complementaria. 3. Todos los kits se utilizaron según las instrucciones del fabricante. La cuantificación de la expresión genética del pliegue relativo se realizó utilizando el 2^–∆∆Ct método con normalización a la TBP gen de referencia (TBP Ct rango 0.5) y la expresión génica media de la microglía de control para cada experimento.

Secuenciación de ARN

Tres líneas de iPSC de control sano y tres líneas de iPSC derivadas de pacientes C9orf72-ALS se diferenciaron en microglía, con tres diferenciaciones independientes por línea. El ARN se extrajo como se describe anteriormente. Todas las muestras de ARN mostraron valores RIN de al menos 8.5. Luego se realizó la preparación de muestras y el análisis bioinformático como se describió anteriormente.¹⁷. Brevemente, las muestras se normalizaron a 100 ng antes de la preparación de la biblioteca. El enriquecimiento del transcrito poliadenilado y la preparación de la biblioteca específica de la cadena se completaron utilizando el kit de ARNm NEBNext Ultra II (NEB) siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuenciación de extremos emparejados (longitud de lectura: 150 pares de bases) se realizó utilizando una plataforma NovaSeq6000 (Illumina, kit de reactivos NovaSeq 6000 S2/S4, v1.5, 300 ciclos), generando un recuento de lecturas sin procesar de un mínimo de 30 M de lecturas por muestra. . Las lecturas de extremos emparejados se asignaron al genoma de referencia humano GRCh38.p13 (https://www.gencodegenes.org) usando HISAT2 v2.2.1⁴¹. La tabla de recuentos se obtuvo utilizando FeatureCounts v2.0.1⁴². La normalización de los recuentos y el análisis de expresión diferencial se realizaron utilizando DESeq2 v1.28.1⁴³ en RStudio 1.4.1103, incluyendo el sexo biológico en el modelo y con el método Benjamini-Hochberg para corrección de pruebas múltiples. Las tres diferenciaciones diferentes por condición se fusionaron en un punto de datos, a menos que se indique lo contrario, donde el sexo biológico y la replicación de diferenciación se incluyeron en el modelo. El análisis de datos exploratorios se realizó después de la transformación estabilizadora de la varianza de la tabla de recuentos, utilizando el análisis de componentes principales. Registro₂ cambio de plegado (registro₂ fc) la contracción se realizó utilizando el enfoque "normal". Genes con | registro₂ fc| > 0.5 y ajustado p-valor <0.05 se definieron como genes expresados ​​diferencialmente (DEG). Los datos se interpretaron con anotaciones de la base de datos Gene Ontology utilizando clusterProfiler v3.16.1.⁴⁴. Analizamos el enriquecimiento de la vía realizando un análisis de sobrerrepresentación (ORA) para todos los DEG y análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en todo el transcriptoma clasificado por log.₂fc, utilizando la configuración estándar en clusterProfiler para ORA y GSEA (ajustada p-valor < 0.05 utilizando el método de Benjamini-Hochberg).

Inmunofluorescencia

Las células cultivadas en cubreobjetos se fijaron previamente con paraformaldehído (PFA) al 2% en PBS durante 2 minutos a temperatura ambiente (RT) y luego se fijaron con PFA al 4% en PBS durante otros 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la permeabilización y el bloqueo con suero de burro al 5 % y Triton X-0.2 al 100 % en PBS durante 1 h a temperatura ambiente, los cubreobjetos se incubaron con los anticuerpos primarios enumerados en la tabla complementaria. 2, diluido en suero de burro al 1% y Triton X-0.1 al 100% en PBS, a 4 °C ON. Después de tres lavados con PBS-0.1% Triton X-100 durante 5 minutos cada uno, los cubreobjetos se incubaron con los correspondientes anticuerpos secundarios fluorescentes Alexa Fluor® 488/568/647 burro anti-ratón/conejo/cabra/cobaya (todos 1:1000, ThermoFisher o Abcam). Luego, los cubreobjetos se lavaron dos veces con PBS-Triton X-0.1 al 100% durante 5 minutos cada uno y se incubaron con DAPI (1 µg/ml, Sigma-Aldrich) en PBS durante 10 minutos. Después de un paso de lavado adicional de 5 minutos con PBS-0.1% Triton X-100, los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de microscopía utilizando el soporte Antifade ProLong™ Diamond, Gold o Glass (ThermoFisher). La microscopía confocal se realizó utilizando un microscopio LSM 710, LSM 880 (ambos Zeiss) o Fluoview FV1000 (Olympus).

Análisis de ramificaciones microgliales.

Se tomaron de cuatro a cinco imágenes de pila z (intervalo z: 1 μm) de campos visuales seleccionados al azar con un aumento de 60x para cada cubreobjetos, y se generaron proyecciones de intensidad máxima en Fiji. Para analizar la ramificación de la microglía positiva para IBA1 en monocultivo y cocultivo, el volumen celular, el índice de ramificación, la longitud promedio de las ramas y el número de puntos de ramificación se determinaron automáticamente utilizando 3DMorph como se describe en otra parte.¹⁹.

Cuantificación de la mala localización de TDP-43 en microglia

Se tomaron de cuatro a cinco imágenes de pila z de campos visuales seleccionados al azar con un aumento de 60x para cada cubreobjetos, y se generaron proyecciones de máxima intensidad en Fiji. Los valores de intensidad media para TDP-43 en el núcleo y el citoplasma se determinaron de forma ciega, utilizándose la señal DAPI e IBA1 para identificar los límites nuclear y citoplasmático, respectivamente. Luego se calculó la proporción de TDP-43 citoplasmático a nuclear.

Cuantificación de la expresión de marcadores de microglia en monocultivos de microglia.

Se tomaron tres imágenes de pila z de campos visuales seleccionados al azar con un aumento de 40x para cada cubreobjetos, y se generaron proyecciones de máxima intensidad en Fiji. El número de núcleos DAPI positivos e IBA1⁺/DAPI⁺ y TMEM119⁺/DAPI⁺ Las celdas se cuantificaron automáticamente por campo de visualización para cada línea utilizando una macro.

Cuantificación de números y proporciones de microglía y neuronas motoras en cocultivo.

Se tomaron de tres a cinco imágenes de pila z de campos visuales seleccionados al azar con un aumento de 10x o 40x para cada cubreobjetos, y se generaron proyecciones de intensidad máxima en Fiji. Para la microglia, usando una macro, se aplicó un umbral automático en el canal IBA1 para crear una máscara, y se determinó la cantidad de células microgliales para cada campo de visión contando la cantidad de núcleos positivos para DAPI dentro de la máscara IBA1 usando el 'analizar Función de las partículas. Para los MN, se aplicó un umbral automático en el canal TUJ1 para crear una máscara, y la cantidad de neuronas se determinó para cada campo de visión contando la cantidad de núcleos positivos para DAPI dentro de la máscara TUJ1 usando la función "analizar partículas". Para calcular la relación microglia:MN, el número de células microgliales se dividió por el número de MN. Para la evaluación de la supervivencia de MN después de una exposición prolongada a LPS, el número absoluto de MN se normalizó a la media de las líneas de control para determinar la supervivencia relativa de MN teniendo en cuenta los efectos de lote entre diferenciaciones después de un cultivo a largo plazo.

Cuantificación de la expresión de marcadores apoptóticos en cocultivo.

Se tomaron cinco imágenes de pilas z de campos visuales seleccionados al azar con un aumento de 40x para cada cubreobjetos. Se generaron proyecciones de máxima intensidad. Usando una macro, se aplicó un umbral automático en el canal TUJ1 para crear una máscara, y se determinó la expresión del marcador apoptótico CC3 dentro de las neuronas para cada campo de visión cuantificando el área de la señal CC3 dentro de la máscara TUJ1 usando el método 'analizar'. Función de las partículas. Para tener en cuenta los efectos de lote entre diferenciaciones, el cambio en la expresión se generó normalizando las mediciones absolutas con la media de las líneas de control.

Cuantificación del crecimiento de neuritas en cocultivo.

Se obtuvieron de cuatro a cinco pilas z de campos de visión seleccionados aleatoriamente que muestran neuritas pero evitan somas neuronales con un aumento de 60x para cada cubreobjetos. Las proyecciones de intensidad máxima se generaron en Fiji. Usando una macro, se aplicó un umbral automático a la tinción TUJ1 y el crecimiento de neuritas para cada campo de visión se determinó midiendo el área de neuritas positivas para TUJ1 por campo de visión usando la función "analizar partículas" en Fiji.

Análisis de la expresión de sinaptofisina neuronal.

Se tomaron de cuatro a cinco imágenes de pilas z de campos visuales seleccionados al azar con un aumento de 60x para cada cubreobjetos. Las proyecciones de intensidad máxima se generaron en Fiji. Utilizando una macro, se aplicó un umbral automático a la tinción de sinaptofisina para analizar estructuras en forma de puntos, y se determinó el número y el área de partículas de sinaptofisina para cada campo de visión utilizando la función "analizar partículas" en Fiji.

ARNscopio

Los focos de ARN se detectaron utilizando el ensayo RNAscope Multiplex Fluorescent v2 (323100, ACD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, la microglía iPSC fijada con 4% de PFA se deshidrataron secuencialmente con etanol al 50%, 70% y 100% durante 1 minuto cada una y se almacenaron a -20 °C. Después de rehidratar con etanol al 100%, 70% y 50%, las células se incubaron con Tween-0.1 al 20% en PBS, peróxido de hidrógeno y proteasa III (proporción de dilución 1:15) durante 10 minutos cada uno, con lavados con PBS en el medio. Sondas dirigidas al (G₄C₂)_n y C₄G₂)_n Se agregaron expansiones (ACD, 884351-C2 y 884361-C2) a cubreobjetos separados y se incubaron durante 2 h, seguido de pasos de amplificación y desarrollo de acuerdo con el protocolo estándar. La ICC secuencial se realizó mediante incubación con anticuerpo primario contra IBA1 (1:200, 019-19741, Wako Fujifilm) durante 2 h a temperatura ambiente y luego según el protocolo de inmunofluorescencia detallado anteriormente.

Cuantificación de la formación de focos de ARN en microglia.

Se tomaron cinco imágenes de pila z de campos visuales seleccionados al azar con un aumento de 40x o 63x para cada cubreobjetos, y se generaron proyecciones de intensidad máxima en Fiji. El número de células con focos positivos y el número de focos por núcleo con focos positivos se determinaron mediante recuento manual.

Ensayo de viabilidad MTS

En experimentos seleccionados, la viabilidad de MN se determinó utilizando el ensayo de proliferación celular CellTiter 96® AQueous One Solution (MTS, G3580, Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las lecturas de las placas se realizaron después de 90 a 120 minutos de incubación con reactivos de ensayo.

Medición de la liberación de citocinas/quimiocinas y neurofilamentos.

Los sobrenadantes del cultivo se recogieron y se centrifugaron a 1200 xg y 4 °C durante 10 min. Las muestras agrupadas se analizaron utilizando el Proteome Profiler Human XL Cytokine Array (ARY022B) o el Protease/Protease Inhibitor Array (ARY025, ambos R&D Systems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La señal se visualizó en un ChemiDoc.^TM Sistema de imágenes MP (Bio-Rad) y analizado utilizando ImageStudioLite v5.2.5 (LI-COR). Además, se utilizaron los ELISA Human DPP4 (DC260B), MMP9 (DMP900), CXCL10 Quantikine (DIP100) y Active MMP9 Fluorokine E (F9M00, todos los sistemas de I+D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La liberación de la cadena ligera (NfL) de neurofilamentos humanos se midió utilizando un ensayo Meso Scale Discovery (MSD) (K1517XR-2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

extracción de proteínas

Las células se enjuagaron con PBS y se complementaron con 100–200 μl de tampón RIPA frío (ThermoFisher) con solución completa.^TM cóctel inhibidor de proteasa y PhosSTOP^TM Se añadió inhibidor de fosfatasa (ambos Merck) a cada pocillo. Se aplicaron 10 impulsos de 1s con morteros motorizados por muestra para homogeneizar los lisados. Después de la incubación en hielo durante 30 min, las muestras se centrifugaron a 12,000 rpm y 4^oC durante 15 min y los sobrenadantes se almacenaron a -80 °C. La cuantificación de la concentración de proteínas se realizó utilizando el Pierce^TM Kit de ensayo de proteína de ácido bicinconínico (ThermoFisher) según las instrucciones del fabricante. Luego se prepararon muestras de proteínas en concentraciones definidas (0.3–1.0 μg/μL) mediante dilución en agua destilada, NuPAGE.^TM cargando buffer y NuPAGE^TM agente reductor de muestra (ambos ThermoFisher). A esto le siguió una incubación a 95 °C durante 5 minutos para desnaturalizar y reducir las muestras.

Western blot

Se cargaron entre 5 y 20 μg de cada muestra y la escalera de proteínas de amplio rango multicolor Spectra o la escalera de proteínas preteñida PageRuler™ (ambas ThermoFisher) en NuPAGE prefabricado.^TM Geles de gradiente Bis-Tris 4–12% (ThermoFisher). Las muestras se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) utilizando NuPAGE.^TM Tampón de ejecución MES (ThermoFisher) a 50–130 V. Luego, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa a 20–25 V durante 7 minutos utilizando un sistema de transferencia en seco iBlot 2 (ambos ThermoFisher). Después del bloqueo con leche al 5 % o BSA en TBS/Tween-0.1 al 20 % (TBS-T, ThermoFisher) a temperatura ambiente durante una hora, las membranas se incubaron con los anticuerpos primarios enumerados en la tabla complementaria. 4 diluido en leche al 3% o BSA en TBS-T a 4 °C durante la noche. Las membranas se lavaron tres veces con TBS-T durante 7 minutos y luego se incubaron con los correspondientes anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa de rábano picante (HRP) a temperatura ambiente durante 1 h. Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios acoplados a HRP (todos 1:5000): HRP anti-ratón de oveja (NA931V), HRP anti-conejo de burro (NA934V, ambos de GE Healthcare), HRP anti-cabra de burro (PA1-28664, ThermoFisher) . Las membranas se lavaron nuevamente tres veces con TBS-T durante 7 minutos y luego se incubaron durante un minuto con una solución de quimioluminiscencia mejorada (Millipore). El quimiodoc^TM Se utilizó el sistema de imágenes MP para visualizar la señal. Las intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando Fiji v1.53q.⁴⁵ y normalizado a los genes constitutivos β-actina o GAPDH y la expresión media de los controles para cada experimento. Después del desarrollo, las membranas se lavaron con TBS-T dos veces durante 5 minutos, seguido de una incubación de 10 minutos con Restore.^TM MÁS tampón decapado (ThermoFisher). Después de dos lavados adicionales de 5 minutos con TBS-T, las membranas se bloquearon y se incubaron con nuevos anticuerpos primarios como se describe anteriormente.

Análisis de la expresión de Poly (GA)/(GP)

Las células se lisaron en tampón RIPA (Sigma-Aldrich) suplementado con Mini 2x completo, cóctel de inhibidor de proteasa libre de EDTA (Merck) y SDS al 2% (ThermoFisher) y se homogeneizaron mediante sonicación. Después de la centrifugación a 17,000 × g a 16 °C durante 20 min, el contenido de proteínas de los sobrenadantes se determinó como se describe en los Métodos complementarios. Las muestras se ajustaron a la misma concentración (0.6–1.0 mg/ml) y el inmunoensayo MSD se realizó en singleplex utilizando placas SECTOR (MSD) de 96 pocillos para cuantificar la expresión de Poly(GA)/(GP), como se describió anteriormente.²⁰. En resumen, las placas se recubrieron con anticuerpos anti-poli(GP) o anti-poli(GA) no marcados. Después del bloqueo, las muestras se cargaron con 45 µg de proteína por pocillo para el inmunoensayo de poli(GP) y con 27 µg de proteína para poli(GA). Se utilizaron como detectores anticuerpos anti-poli (GP) y anti-poli (GA) biotinilados, seguidos de estreptavidina marcada con sulfo (Meso Scale Discovery, R32AD). Las placas se leyeron con el tampón de lectura MSD (Meso Scale Discovery, R92TC) utilizando el MSD Sector Imager 2400. Las señales corresponden a la intensidad de la luz emitida tras la estimulación electroquímica de la placa de ensayo. Antes del análisis, se restó de cada lectura la lectura promedio de un calibrador que no contenía péptido. Las señales negativas se establecieron en '0'.

Estadística y reproducibilidad

No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra. Los investigadores estaban cegados a la asignación durante los análisis si el diseño experimental lo permitía. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 9. No se excluyeron datos de los análisis. Se combinaron datos de múltiples líneas y diferenciaciones para comparar el efecto general de la C9orf72 HRE versus controles. Las comparaciones de dos grupos se realizaron mediante pruebas t no pareadas de dos colas y comparaciones de grupos múltiples mediante ANOVA unidireccional o bidireccional con pruebas post hoc apropiadas como se indica en las leyendas de las figuras. El número de experimentos independientes y líneas se indican en la leyenda de cada figura. Los datos se presentan como puntos de datos únicos y medias ± SEM. Las diferencias se consideraron significativas cuando P < 0.05 (*P <0.05; **P <0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; ns: no significativo). Los diagramas de caja muestran la mediana (línea central), los cuartiles superior e inferior (límites de caja), el rango intercuartil de 1.5 veces (bigotes) y los valores atípicos (puntos). Se utilizaron GraphPad Prism 9 o RStudio 1.4.1103 para trazar los datos. El montaje final de las figuras se realizó utilizando Adobe Illustrator 25.4.1.

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de la cartera de naturaleza vinculado a este artículo.

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41467-023-41603-0