Construcción de plásmidos

La secuencia completa de aminoácidos de cada receptor construido se muestra en Información complementaria (Fig. 1). Un plásmido principal pMK-stuffer-IPTG²⁵ se usó para la infección retroviral, en la que el sitio de entrada ribosomal interno (IRES; I) se usa para la coexpresión de los genes que codifican una resistencia a la puromicina (P), un péptido T2A autoescindible (T) y una proteína de fluorescencia verde mejorada. (EGFP; G). El marco de lectura abierto que codifica cada secuencia de receptor se amplificó con PCR y se insertó en pMK-stuffer-IPTG usando el kit de clonación In-fusion HD (TakaraBio). La subclonación, amplificación y secuenciación de cada plásmido se realizaron según un protocolo estándar.

Para la construcción de una biblioteca de motivos, elegimos los procedimientos de digestión/ligadura como un método confiable. Los codones NNS se asignaron en un cebador de PCR para aleatorizar 3 residuos de aminoácidos aguas abajo de la tirosina del motivo de unión a STAT1. Los fragmentos de ADN aleatorizados se generaron mediante PCR utilizando pMK-F1-IPTG, que codifica el receptor diseñado con el motivo de unión a STAT1, como plantilla, escindido con EcoRI y claI, y se ligó a pMK-F1-IPTG digerido con las mismas enzimas para producir pMK-F1lib-IPTG. Se electroporaron células MegaX DH10B T1R Electrocomp (ThermoFisher Scientific) con pMK-F1lib-IPTG (100 ng) usando Gene PulserII (Bio-Rad) configurado a 2.0 kV, 200 Ω y 25 µF. Todo E. coli Las células se sembraron en una placa LB de gran tamaño para garantizar la obtención de un número suficiente de colonias resistentes a los antibióticos que excedieran el tamaño teórico de la biblioteca de ADN (3.3 × 10⁴) de las mutaciones aleatorias de 3 aminoácidos creadas por codones NNS degenerados. Las colonias se recolectaron para extraer plásmidos utilizando el kit QIAGEN Plasmid Midi (Qiagen).

Transducción de vectores clonales

Para la transducción de células Ba/F3 (RIKEN Cell Bank #RCB0805, Ibaraki, Japón), se sembraron células Plat-E de embalaje retroviral (proporcionadas amablemente por el Dr. T. Kitamura, Universidad de Tokio) en placas de 6 pocillos un día antes. transfección. Al día siguiente, se mezclaron en un tubo 3 µg de un plásmido transgénico, 3 µL de reactivo PLUS (ThermoFisher Scientific) y 150 µL de Opti-MEM (ThermoFisher Scientific), mientras que en otro tubo se mezclaron 7.5 µL de reactivo Lipofectamine LTX ( Se mezclaron ThermoFisher Scientific) y 150 µL de Opti-MEM. Luego, las mezclas derivadas de los dos tubos se mezclaron y se agregaron a las células Plat-E precultivadas (día 0). El medio de cultivo se cambió el día 1. El día 2, se recogió el sobrenadante retroviral, se filtró con una membrana de PVDF de 0.45 µm, se añadió a placas de 24 pocillos recubiertas con Retronectina (TakaraBio) y se dejó durante 6 h a temperatura ambiente. La retronectina puede co-localizar células y partículas retrovirales, lo que conduce a una alta eficiencia de transducción y, por lo tanto, acorta el tiempo necesario para obtener un número suficiente de células de transductantes para análisis posteriores. Después de lavar con PBS una vez, las células Ba/F3 (1.0 × 10⁵ células/pocillo) se sembraron en las placas, seguido de la adición de 1 µg/ml de puromicina el día 3 o 4 para seleccionar células transducidas de forma estable.

Las células Ba/F3 se pueden transducir con partículas retrovirales con envoltura ecotrópica, mientras que las células 32Dcl3 (RIKEN Cell Bank #RCB1377) no pueden. Por lo tanto, se transdujeron células 32Dcl3 con partículas retrovirales pseudotipadas con la envoltura VSV-G. Para la transducción de células 32Dcl3, se utilizaron células 293GP (proporcionadas amablemente por el Dr. M. Otsu, Universidad de Kitasato) para el empaquetado retroviral pseudotipo.⁹. El protocolo de transfección fue el mismo que en el caso de las células Ba/F3, excepto que se utilizaron 2.25 µg de un plásmido transgénico y 0.75 µg de pCMV-VSV-G. El día 2, el sobrenadante retroviral se centrifugó a 6000 g durante 16 h a 4 °C y se concentró 100 veces con medio RPMI como disolvente. El virus concentrado se añadió a células 32Dcl3 (1.0 x 10⁵ células) con 10 µg/ml de sulfato de protamina, seguido de la adición de 3 µg/ml de puromicina el día 3 o 4 para seleccionar células transducidas de forma estable.

Transducción de vectores de biblioteca

En la transducción de vectores de biblioteca, el siguiente protocolo de transducción retroviral que utiliza un reactivo catiónico sulfato de protamina da como resultado empíricamente una eficiencia de transducción de <10 %, lo cual es deseable para la transducción de bibliotecas monoclonales en células receptoras. Los procedimientos generales fueron aproximadamente los mismos que en el caso de la transducción de vectores clonales, excepto que los cultivos celulares y los reactivos utilizados se ampliaron. Los valores ampliados en la transducción de vectores de biblioteca se enumeran a continuación.

Para la transducción de células Ba/F3, se sembraron células Plat-E en una placa de 10 cm; la solución de plásmido era 16 µg de un plásmido transgénico, 32 µL de reactivo P3000 (ThermoFisher Scientific) y 500 µL de Opti-MEM; la solución de lipofectamina fue 21.7 µL de reactivo Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific) y 500 µL de Opti-MEM; 1.0 × 10⁷ Se transdujeron células Ba/F3 en presencia de 10 µg/ml de sulfato de protamina.

Para la transducción de células 32Dcl3, se sembraron células 293GP en una placa de 10 cm; la solución de plásmido era 10 µg de un plásmido transgénico, 2.5 µg de pCMV-VSV-G, 12.5 µg de reactivo PLUS y 1 ml de Opti-MEM; la solución de lipofectamina fue 31 µL de reactivo Lipofectamine LTX y 2.4 ml de Opti-MEM; 1.0 × 10⁷ Se transdujeron células 32Dcl3 en presencia de 10 µg/ml de sulfato de protamina.

Citometría de flujo

Las tasas positivas de EGFP se midieron con FACSCalibur (BD Biosciences).

Proyección de biblioteca

Para la detección de transductantes Ba/F3, las células transducidas (1.1 × 10⁵) se sembraron en placas de 96 pocillos a 1.0 × 10³ células / ml con AP10 20187 nM (TakaraBio) el día 0. Para ayudar al crecimiento de células clonales en la condición de dilución limitante, las células parentales no transducidas (3.0 × 10⁵ células/mL) se mezclaron como células alimentadoras. Las colonias en crecimiento se ampliaron a placas de 24 pocillos y posteriormente a placas de 6 cm. Finalmente, los 18 clones celulares más rápidos se sometieron a más ensayos. El ADN genómico se extrajo con el kit DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN). Se realizó una PCR genómica para amplificar la región aleatorizada. Los fragmentos amplificados fueron sometidos a secuenciación. Se realizaron los mismos procedimientos para la detección de transductantes 32Dcl3.

Ensayo de proliferación celular

Las células se lavaron con PBS dos veces y se sembraron en placas de 24 pocillos en el medio de cultivo que contenía diversas concentraciones de AP20187 (TakaraBio), 1 ng/ml de IL-3 (ThermoFisher Scientific) o 10 ng/ml de G-CSF (R&D). Sistemas). Las densidades de células viables se estimaron mediante el Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories) midiendo la absorbancia a 450 nm utilizando el lector de microplacas GloMax Discover (Promega).

Western blotting

Los procedimientos experimentales detallados para la transferencia Western se describieron anteriormente.³². En los análisis de señalización, las células se cultivaron en el medio sin IL-3 durante 10 a 16 h y posteriormente se estimularon con AP10 20187 nM, IL-1 3 ng/ml o G-CSF 10 ng/ml a 37 °C durante 15 minutos. En el ensayo de expresión de MPO, las células se cultivaron en el medio que contenía AP10 20187 nM, IL-1 3 ng/ml o G-CSF 10 ng/ml durante 5 días. Las proteínas de los lisados ​​celulares se resolvieron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se sondaron con anticuerpos primarios y secundarios. Los anticuerpos utilizados se enumeran en Información complementaria (Fig. 2).

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41598-023-42378-6