Cultivo de células

Las mESC E14 se compraron del Banco de Células Madre de la Academia China de Ciencias. Fueron cultivados a 37 °C en 5% de CO.₂ en una incubadora. El medio de cultivo fue Knockout DMEM (Gibco, 10829-018), al que se le añadió suero bovino fetal al 15% (FBS, Gibco, 10099-141), 1× MEM de aminoácidos no esenciales (Gibco, 11140-050), 1× GlutaMAX (Gibco , 35050-061), 50-mercaptoetanol 2 μM (Sigma, M3148), LIF 1000 UI/mL (Millipore, ESG1107), PD1 0325901 μM (Selleck, S1036) y CHIR3 99021 μM (Selleck, S2924) [25]. Las mESC se mantuvieron en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) tratados con mitomicina C para su paso o en placas recubiertas de gelatina al 0.1% para los ensayos. El medio se cambió todos los días y las células se pasaron cada 3 días.

Nocaut de Haspin en mESC

Para eliminar a Haspin, diseñamos dos ARN guía (ARNg) dirigidos a secuencias codificantes de Haspin. Los gRNA se hibridaron y luego se clonaron en el vector pX459 digerido con BbsI. Estos dos plásmidos de ARNg de Haspin se cotransfectaron en células WT E14 utilizando Lipofectamine 2000 (Lip2000, Invitrogen, 11668019). 24 h después de la transfección, el medio se cambió a medio ES suplementado con 1.5 μg/ml de puromicina durante 3 días, y los clones individuales supervivientes se seleccionaron y transfirieron a placas de 96 pocillos. Para obtener células Haspin-KO, utilizamos inmunotinción de H3T3ph para seleccionar clones individuales negativos de H3T3ph. Luego, los fragmentos de ADN genómico de las células Haspin-KO se amplificaron mediante PCR y se secuenciaron para confirmar que el gen Haspin estaba alterado.

Inducción de la división asimétrica de células madre.

Al analizar la capacidad de división asimétrica de células madre, las mESC E14 se cambiaron a medio N2B27 y se incubaron durante 16 h en placas de cultivo celular con fondo de vidrio recubiertas de gelatina (Nest, 801001) después del paso. El medio N2B27 incluye DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), Neurobasal (Gibco, 21103-049) (1:1), 50-mercaptoetanol 2 µM, N0.5 al 2 % (Gibco, 17502-048), B1 al 27 % (Gibco , 17504-044), solución de BSA al 0.033 % al 7.5 % (Thermo Fisher, 15260037) y 1 × GlutaMAX (Gibco, 35050-061) [24]. Después de 16 h, se realizaron inmediatamente experimentos de tinción por inmunofluorescencia en las células y luego se prepararon las células para la obtención de imágenes confocales. nanog, uno de los principales marcadores de pluripotencia, siempre se ha utilizado para determinar el índice ACD [24,25,26]. Cuando la relación de señal de Nanog entre las dos células hijas es mayor que 1.2, se considera ACD.53].

Construcción y sobreexpresión de plásmidos.

Los vectores Chek2-eGFP y Chek2-RFP se obtuvieron del Dr. Zhiyong Mao. Amplificamos las secuencias codificantes de Haspin y Wnt5a a partir del ADNc de mESC y luego las subclonamos en el vector Chek2-eGFP para desplazar la secuencia codificante de Chek2. Para la sobreexpresión, se transfectó el vector Haspin-eGFP o Wnt5a-RFP en mESC E14 utilizando Lip2000. Después de 3 días de transfección, las células positivas para GFP se purificaron con citometría de flujo utilizando fluorescencia verde. La eficiencia de la sobreexpresión se midió mediante qRT‒PCR y transferencia Western.

siRNA

Las células E14 se transfectaron con siRNA dirigido cerrojo or Wnt5a durante 48 h usando Lip2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cerrojo y Wnt5a Ribobio (Guangzhou, China) sintetizó los ARNip y sus secuencias de ADN objetivo se muestran en la tabla complementaria. 1.

Inhibidor de haspin quinasa CHR-6494

El inhibidor de la quinasa Haspin CHR-6494 (MCE, HY-15217) se disolvió en DMSO para generar una solución madre 10 mM y luego se almacenó a -20 °C.27]. Después del paso y la adherencia de las células, el medio se cambió a medio ES añadido CHR-0.5 1 μM o medio N6494B2 27 μM o CHR-1 XNUMX μM, y se usó DMSO XNUMX μM como control. El medio se cambió todos los días.

sincronización celular

Para medir el nivel de H3T3ph, sincronizamos los mESC. Las células se sincronizaron con la metafase mediante el tratamiento con 1 μg/ml de colchicina (Sigma, C3915) durante 8 h, y luego, las células se recogieron para transferencia Western o tinción por inmunofluorescencia.

Tinción con fosfatasa alcalina

La tinción con fosfatasa alcalina (AP) de mESC se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el kit de detección de fosfatasa alcalina (Millipore, SCR004). Primero, las células se fijaron durante 1 min a temperatura ambiente con paraformaldehído al 4% en PBS y luego se lavaron durante 5 min con 1X PBST. A continuación, se aplicaron una solución Fast Red Violet y una solución de fosfato Naftol AS-BI a las mESC durante 10 minutos en la oscuridad. Las células teñidas se lavaron con PBS 1X y se examinaron con un microscopio invertido.

Curvas de crecimiento

Se sembraron aproximadamente 20,000 células en cada pocillo de placas de 24 pocillos (Thermo, 142475). Luego, se generaron curvas de crecimiento a las 24, 48, 72, 96 y 120 h, y se contaron tres pocillos de cada línea para determinar el número de células. El número de células se midió mediante Countess II (Thermo) según el protocolo del fabricante. Las células restantes se lavaron con PBS 1X y el medio se reemplazó diariamente con medio nuevo.

Análisis del ciclo celular

Las mESC E14 se sembraron en una placa de cultivo celular de seis pocillos (Thermo, 140675). Tres días después, las células se tripsinizaron y se fijaron en etanol al 70% frío durante la noche a 4 °C. Las células se resuspendieron y se incubaron con solución de RNasaA a 37 °C durante 30 min, seguido de incubación con 50 μg/mL de solución de yoduro de propilidina (PI) durante otros 30 min a temperatura ambiente. Luego, se utilizó BD FACS Aria ll para evaluar la frecuencia de las células en las fases G1, S y G2/M.

Generación de cuerpo embrioide

Se utilizó el método de la gota colgante para generar cuerpos embrioides (CE). Las células E14 se disociaron y resuspendieron en medio EB a una concentración de 1–1.5 × 10⁵ células/mL. Medio EB que contiene DMEM Knockout, FBS al 15 %, 1 × aminoácidos no esenciales MEM, 1 × piruvato de sodio y 0.1-mercaptoetanol 2 mM [54]. Luego, se cultivaron 20 µL de gotas colgantes durante tres días en la tapa de un plato de 10 cm. Para evitar que la gota colgante se seque, se colocó 1x PBS en la parte inferior de la tapa. Después de tres días, se recogieron las EB, se transfirieron a placas de adhesión ultrabaja (Corning, 3474) y se cultivaron en medio EB durante otros 3 días. Se recolectaron muestras de EB y luego se sometieron a qRT‒PCR para analizar los niveles de expresión génica.

Formación de teratoma

Los ratones se alojaron y trataron según las directrices del Comité del Instituto de Investigación Animal de la Universidad de Tongji, Shanghai, China. Para la formación de teratoma, se tripsinizaron células E14 para producir células individuales. Para cada tipo de celda, un total de 1 × 10⁶ Las células se resuspendieron en 100 μl de medio EB y se inyectaron por vía subcutánea en los dos flancos de ratones machos NOD-SCID inmunodeficientes de 8 semanas de edad (n = 4 tumores/grupo). Cuatro semanas después de la inoculación, se recogieron y pesaron los teratomas. Luego, estos teratomas se recogieron en PFA al 4%, se incluyeron en parafina y se seccionaron en un microtomo. Se tiñeron secciones de cada teratoma con hematoxilina/eosina (H&E) y se analizaron más a fondo.

PCR cuantitativa en tiempo real (qRT‒PCR)

El ARN total se extrajo de mESC, EB y teratomas de WT y Haspin-KO utilizando TRIzol (Invitrogen, 10296010) de acuerdo con el protocolo. El ARN total se cuantificó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo). Luego, la transcripción inversa en ADNc se realizó mediante el kit de reactivos PrimeScript RT con gDNA Eraser (Takara, RR047). qRT‒PCR se realizó utilizando TB Green Fast qPCR Mix (Takara, RR430) con un volumen de reacción de 20 μL y el sistema Bio-Rad CFX Connect (Bio-Rad). Los niveles relativos de expresión de ARNm se normalizaron a GAPDH y analizado utilizando el método 2-delta-delta-Ct para calcular el cambio relativo. Las secuencias de cebadores se enumeran en la tabla complementaria. 1.

Tinción de inmunofluorescencia

Para la tinción por inmunofluorescencia, las células cultivadas en placas de cultivo celular con fondo de vidrio se fijaron con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las muestras se permeabilizaron con PBST (0.2% Triton X-100) a temperatura ambiente durante 30 min. Luego, las células se bloquearon con BSA al 5% a temperatura ambiente durante 1 h. Luego, las muestras se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios a 4 °C. Además, las muestras se lavaron tres veces con PBST y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h con anticuerpos secundarios y Hoechst 33342 (Invitrogen, H3570). Luego, las muestras se lavaron en PBST tres veces a temperatura ambiente y se almacenaron en la oscuridad. Las imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio invertido Zeiss-LSM880. Los datos se procesaron utilizando el software Zeiss y el software ImageJ.

Western blotting

Para la extracción de proteínas, las mESC se lisaron utilizando tampón RIPA (Beyotime, P0013B) suplementado con inhibidores de proteasa (Beyotime, P1005) e inhibidores de fosfatasa (Beyotime, P1081), y luego, los lisados ​​se centrifugaron a 12,000 rcf y 4 °C durante 20 min. . La concentración de proteína del sobrenadante se determinó utilizando el ensayo de proteínas BCA (Thermo, 23227) y luego se normalizó. Se separaron cantidades iguales de muestras de proteínas utilizando geles SDS‒PAGE al 15% y luego se transfirieron a membranas de PVDF de 0.2 μm (Millipore, ISEQ00010). Las membranas se bloquearon con TBST suplementado con BSA al 5% a temperatura ambiente durante 1 h y luego se incubaron con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche. A continuación, las membranas se lavaron tres veces con TBST seguido de anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se visualizaron con el reactivo de quimioluminiscencia ECL (Thermo, 34577).

RNA-seq y análisis de datos

El ARN se extrajo de Haspin-KO y las mESC de control utilizando TRIzol. Luego, se preparó 1 μg de ARN para generar una biblioteca de secuenciación. Las bibliotecas se secuenciaron en IIIumina NovaSeq 6000 (Berry genómica) de acuerdo con el protocolo. Para el análisis de datos, las lecturas recortadas (usando Cutadapt, v1.9.1) se asignaron al genoma del ratón (mm10) usando Hisat2 (v2.0.1). El análisis de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) se realizó utilizando DESeq2. Los DEG significativos fueron identificados con P valores <0.05 y cambio de veces> 2, y luego se utilizó GOSeq (v1.34.1) para identificar términos de ontología genética (GO).

Ensayo informador de luciferasa dual

Amplificamos fragmentos del promotor Wnt5a (~ 2 kb aguas arriba del TSS) y Pax2 CDS, y luego clonamos Wnt5a en el vector indicador de luciferasa pGL3 y Pax2 CDS en el vector de sobreexpresión CAG-eGFP. Las mESC se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 2 × 10⁵ células/mL. Al día siguiente, se cotransfectaron los promotores Pax2-eGFP, pRL-SV40, pGL3-Basic o pGL3-Wnt5a en células usando Lip2000 y se cultivaron durante 36 h. Por otro lado, el promotor pRL-SV40 y pGL3-Wnt5a se cotransfectaron en células WT. Después de 8 h, a las células transfectadas se les administró medio que contenía WT, DMSO, CHR-0.5 6494 μM y CHR-1 6494 μM y se incubaron durante 36 h. Luego, las células se recogieron y se lisaron para medir la actividad luciferasa según el protocolo del fabricante (Promega, E1910).

Inmunoprecipitación de cromatina

Los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) se realizaron con el kit Magna ChIP A/G (Millipore) de acuerdo con el protocolo. Brevemente, las mESC se entrecruzaron y luego se sonicaron en fragmentos de 200 a 500 pb, que luego se inmunoprecipitaron con anticuerpos contra Pax2 (Cell Signaling Technology, 9666) o IgG. Luego, el ADN de la cromatina precipitado se recuperó y analizó mediante ensayos qRT-PCR.

Anticuerpos

Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios para la transferencia Western o la tinción por inmunofluorescencia: anti-H3T3ph (Abcam, ab130940), anti-H3S10ph (Abcam, ab14955), anti-GAPDH (Proteintech, HRP-60004), anti-caspasa-3 (Cell Signaling Technology, 9662S), caspasa-3 anti-escindida (Cell Signaling Technology, 9664S), anti-α-tubulina (motivo activo, 39527), anti-Nanog (Abcam, ab80892), anti-Sox2 (Abcam, ab79351), anti -Oct4 (Abcam, ab27985), anti-Klf4 (Abcam, ab129473), anti-Wnt5a (Abcam, ab235966) y anti-Pax2 (Cell Signaling Technology, 9666).

análisis estadístico

Todos los datos estadísticos se presentan como media ± SEM. Cada prueba se repitió al menos tres veces y los resultados se analizaron con SPSS 20.0. La significación estadística entre grupos se determinó mediante pruebas t de Student de dos colas no apareadas. *P < 0.05, **P < 0.01 y ***P < 0.001 se consideraron diferencias estadísticamente significativas, y P > 0.05 se consideró no significativo.

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41420-023-01604-w