Cultivo de células

Líneas ESC de ratón (Rex1GFP-d2 y E14IVc¹³⁷) se cultivaron en condiciones sin alimentador [plástico recubierto con gelatina al 0.2 % (Sigma, cat. G1890)] y se volvieron a sembrar cada 3 o 4 días en una proporción de división de 1:10 después de la disociación con Accutase (GE Healthcare, cat. L11-007) o tripsina al 0.25 % (Life Technologies). Las células se cultivaron en medio basado en N2B27 sin suero [DMEM/F12 y Neurobasal en proporción 1:1, β-mercaptoetanol 0.1 mM, L-glutamina 2 mM, N1 200:2 y B1 100:27 (todos los reactivos de Life Technologies)] o medio KSR que contenía suero [GMEM (Sigma, cat. G5154) suplementado con KSR al 10 % (Life Technologies ), FBS al 2 % (Sigma, cat. F7524), β-mercaptoetanol 100 mM (Sigma, cat. M7522), aminoácidos no esenciales 1× MEM (Invitrogen, cat. 1140-036), L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM (ambos de Invitrogen)], complementado con dos inhibidores de molécula pequeña (2i) PD (PD0325901) 1, 99021 μM), CH (CHIR3, 1386 μM) de Axon (cat. 1408 y 100) y LIF (XNUMX unidades/ml adquiridas en Qkine, Cambridge, Reino Unido).

Las iPSC humanas CS09iHD-109n5 (aquí denominadas iPSC_Q109) y CS14iCTR-21n3 (aquí denominadas iPSC_Q21) adquiridas en Cedars-Sinai Biomanufacturing Center (Los Ángeles, California), se mantuvieron en placas de Matrigel al 0.5 % (CORNING, cat. 356231) prerrecubiertas en medio E8 fabricadas internamente (según Chen et al. , 2011¹³⁸) o en mTeSR (StemCell Technologies, cat. 05850) a 37 °C, 5% O², 5% CO². Las iPSC humanas se disociaron en grupos con EDTA 0.5 mM (Gibco, cat. AM99260G) y se volvieron a sembrar en una dilución 1:6 cada 3-4 días con inhibidor de ROCK 10 μM (Y27632-diclorhidrato Axon Medchem, cat. 1683) durante 24 horas. El medio se cambió todos los días. Todas las líneas celulares fueron negativas para micoplasma.

Genotipado de iPSC_Q21 y iPSC_Q109

El ADN genómico de iPSC_Q21 e iPSC_Q109 se aisló con el kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, cat. 69504) siguiendo las instrucciones del fabricante y se cuantificó con Nanodrop ND-1000. La PCR se realizó utilizando los cebadores enumerados en la Tabla complementaria 1 y descrito en Mangiarini et al.²⁹, diseñado para amplificar el tracto polyQ en el exón 1 de HTT. Para una reacción de 25 μL usamos 200 ng de ADN genómico, 0.25 μL de Taq Phusion High fidelity (ThermoFisher, cat. F-530L), 2.5 μL de Buffer GC 5x + MgCl² (7.5 mM), 2 μL de dNTPs (10 mM) y 1.25 μL de Dimetilsulfóxido (DMSO, 100%). Luego de 3 minutos a 94 °C, realizamos 35 ciclos de: 94 °C por 1 minuto, 63 °C por 45 segundos, 72 °C por 1 minuto, seguido de una elongación final a 70 °C por 7 minutos. La electroforesis en gel se realizó en gel de agarosa al 2.5%, cargando 20 μL de productos de PCR con Purple Loading Dye 6x (NEB, cat. B7024S). Se usó β-actina como control de carga. Los resultados fueron adquiridos digitalmente por VWR Imager CHEMI Premium.

Generación de líneas ESC que expresan HTT

Las células Q15 y Q128 se generaron por transfección de ADN de vectores que contenían N-terminal del gen de la huntingtina humana, con 128 o 15 repeticiones CAG respectivamente (cortesía de la profesora Elena Cattaneo). La linealización durante la noche del ADN del plásmido se realizó con la enzima de restricción PvuI. Para la transfección de ADN, usamos Lipofectamine 2000 (Life Technologies, cat. 11668-019) y realizamos una transfección inversa. Para un pocillo de una placa de 6 pocillos, utilizamos 6 μl de reactivo de transfección, 2 μg de ADN plasmídico y 300,000 2 células en 1 ml de medio. El medio se cambió después de la incubación durante la noche. La selección de antibióticos (puromicina 24 μg/mL) comenzó XNUMX horas después de la transfección.

Generación de ESC de ratón que expresan establemente genes de interés

Los candidatos que expresan ESC de ratón transgénico estable se generaron mediante la transfección de células que expresan HTT con plásmidos de transposón PB (1 μg de CAG-Mtf1, CAG-Kdm2b, CAG-Kdm5b y CAG-Fbxo34), adquiridos de VectorBuilder (VectorBuilder Inc, Chicago, IL, EE. UU.), con vector de expresión de transposasa PB pBase (1 μg). Usamos Lipofectamine 2000 y realizamos una transfección inversa como se describe para la generación de líneas HD. La selección de antibióticos (Higromicina B, 150 μg/mL; Invitrogen, cat. 10687010) comenzó 24 horas después de la transfección.

diferenciación de PNJ

iPSC_Q21 e iPSC_Q109 se diferenciaron en NPC según Li et al., 2011⁹² protocolo. Las iPSC con una confluencia del 80 % se disociaron en células individuales con Accutase (Gibco, cat. A1110-501) y se sembraron en placas con 45,000 XNUMX células/cm² en medio E8 con inhibidor de ROCK 10 μM. Después de 1 día, el medio E8 se sustituyó por medio de inducción N2B27 compuesto por Advanced DMEM/F12 (Gibco, cat. 12634-010): Neurobasal (Gibco, cat. 21103-049) (proporción 1:1), BSA 50 mg/mL (Gibco, cat. 15260-037), Glutamax 1 % (Gibco, cat. 35050) -038), Penicilina/Estreptomicina 1% (Gibco, cat. 15140122), N2 Suplemento 1:200 (Gibco, cat. 17502-048), B27 Suplemento 1:100 (Gibco, cat. 17504-044), suplementado con moléculas pequeñas LIF humano 10 ng/mL (Qkine, cat. Qk036), SB431542 2 1661 μM (Axon Medchem, cat. 99021), CHIR3 1386 μM (Axon Medchem, cat. 0.1), Compuesto E 209986 μM (Sigma-Aldrich, cat. 17-4-2). El medio de inducción N27B7 se cambió todos los días, durante 7 días. El día 1, los NPC se dividieron a una dilución de 6:2 en medio de mantenimiento N27B12 que se compone de Advanced DMEM/F12634 (Gibco, cat. 010-21103): Neurobasal (Gibco, cat. 049-1) (proporción 1:50), BSA 15260 mg/mL (Gibco, cat. 037-1), Glutamax 35050% (Gibco, cat. 038-1), Penicilina/Estreptomicina 15140122% (Gibco, cat. 2), N1 Suplemento 200:17502 (Gibco, cat. 048-27), B1 Suplemento 100:17504 (Gibco, cat. 044-10), suplementado con moléculas pequeñas LIF humano 036 ng/ml (Qkine, cat. Qk431542 2), SB1661 99021 μM (Axon Medchem, cat. 3), CHIR1386 20 μM (Axon Medchem, cat. 236), suplementado con EGF 2 ng/mL (R&D, cat. 20-EG) y FGF002 2 ng/mL (Qkine, cat. Qk6, pez cebra recombinante FGF1). Los NPC se mantuvieron durante XNUMX pases. Los datos de morfología de h-iPSC y NPC se recopilaron digitalmente con el microscopio Zeiss Axio Vert AXNUMX FL-LED.

Generación de NPC que expresan transitoriamente genes de interés

Para la transfección de ADN, se disociaron 250,000 1110 NPC como células individuales con Accutase (Gibco, cat. A501-1) y se transfectaron con construcciones PB (2311 μg) usando FuGENE HD Transfection (Promega, cat. E12), siguiendo el protocolo para transfección inversa. Para un pocillo de una placa de 3.9 pocillos, utilizamos 1 μL de reactivo de transfección, 250,000 μg de ADN plasmídico y 1 2 células en 27 mL de medio de mantenimiento N10B27632 con 1683 µM Y48 [ROCKi, inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK), Axon Medchem cat. 30]. El medio se cambió después de la incubación durante la noche. Después de 24 horas después de la transfección, las células se trataron con rotenona XNUMX µM durante XNUMX horas y luego se analizaron como se indica en la Fig. 8f.

Ensayo de proliferación

Los ESC de ratón se acondicionaron para un pase en medio KSR + 2iL en presencia de Puromicina 6 μg/mL. La proliferación de ESC se evaluó colocando 15,000 24 células en una placa de 7,500 pocillos (XNUMX células/cm²) en medio KSR + 2iL en presencia de Puromicina 6 μg/mL. Las células se disociaron con tripsina al 0.25 % (Life Technologies) y se contaron cada 24 horas durante 4 días.

La proliferación de iPSC se midió sembrando 40,000 0.5 células individuales en placas de 356231 pocillos de Matrigel al 12 % (CORNING, cat. 11,428) prerrecubiertas (XNUMX XNUMX células/cm²) en medio E8 con inhibidor de ROCK 10 µM (diclorhidrato de Y27632, Axon Medchem, cat. 1683) durante 24 horas. El medio se cambió todos los días. Las células se disociaron con Accutase (GE Healthcare, cat. L11-007) y se contaron cada 24 horas durante 4 días.

La proliferación de NPC se midió sembrando 100,000 0.5 células en placas de 356231 pocillos de Matrigel al 12 % prerrevestido (CORNING, cat. 28,571) (XNUMX XNUMX células/cm²) en medio de mantenimiento N2B27 con inhibidor de ROCK 10 µM (diclorhidrato de Y27632 Axon Medchem, cat. 1683) durante 24 horas. Las células se disociaron con Accutase (GE Healthcare, cat. L11-007) y se contaron cada 24 horas durante 4 días.

Tratamiento de estresores y tinción con cristal violeta (CV)

Para los experimentos en las Figs. 2b, se sembraron 5,000 ESC de ratón en una placa de 24 pocillos (2,500 células/cm²) en medio KSR + 2iL en presencia de los inhibidores (y puromicina 6 μg/ml) durante 48 horas y puntuado mediante la cuantificación del número de células supervivientes mediante tinción CV [solución CV: 0.05 % p/v Crystal Violet (Sigma), 1 % de solución de formaldehído 37 % (Sigma), 1 % metanol, 10 % PBS] y la cuantificación de la intensidad media se realizó con el software Fiji (v2.0.0).

Para la mutagénesis de PB seguida de tratamientos estresantes, las células se sembraron en placas a una densidad de 2,500 células/cm² en Puromicina 6 μg/mL y seleccionado durante 5 días en presencia de MG132 (Sigma-Aldrich, cat. C2211) o Tamoxifeno (Sigma-Aldrich, cat. T2859).

Para los experimentos de la Fig. 4g, se sembraron 5,000 células en una placa de 24 pocillos en medio KSR + 2iL con Puromicina 3 μg/mL. Se añadieron factores estresantes (MG132 12.5 nM o tamoxifeno 13.4 µM) después de 12 horas. La puntuación de las células supervivientes se realizó como se describe anteriormente.

Para los experimentos en la Fig. Suplementaria. 4d, se sembraron 2,500 células en una placa de 48 pocillos en medio KSR + 2iL. Factores de estrés [rotenona (Sigma-Aldrich, cat. R8875), cumeno (Sigma-Aldrich, cat. 247502), 5-azacitidina (Sigma-Aldrich, cat. A1287), MG132 (Sigma-Aldrich, cat. C2211), bafilomicina ( Sigma-Aldrich, cat. B1793), estaurosporina (Sigma-Aldrich, cat. S6942), tamoxifeno (Sigma-Aldrich, cat. T2859)] después de 12 horas a las concentraciones indicadas. Después de 48 horas, las células supervivientes se tiñeron con solución de CV y ​​se realizó la puntuación de las células supervivientes como se ha descrito anteriormente.

Electroporación del sistema PB en ESC

Se realizó mutagénesis mediada por PB por electroporación para el cribado de todo el genoma. Los vectores PB se integran de manera estable en el genoma después de la inserción aleatoria en los sitios TTAA. El vector PB pGG134 utilizado (mostrado en la Fig. 2a) fue optimizado para pantallas de ganancia de función⁵⁴: consta del potenciador/promotor de MSCV seguido de un sitio donante de empalme del exón 1 de zorrof2 gen, que permite la sobreactivación de genes cercanos. El PB 5'-ITR también tiene una actividad promotora direccional débil, es decir, esta construcción puede activar genes en cualquier orientación. El vector también contiene un segundo casete, que incluye un promotor constitutivo seguido de genes de resistencia a la higromicina y DsRed, que se utilizó para identificar células con integración estable del vector.

Optimizamos las condiciones para lograr un número bajo de eventos de integración, ajustando la proporción del vector PB frente a la transposasa pBase. Para el procedimiento de selección, la mutagénesis se realizó utilizando la cantidad optimizada de 0.5 μg de pGG134 y 20 μg de pBase.

Para una sola electroporación, 10⁷ Se mezclaron células y 20.5 µg de ADN y se colocaron en una cubeta de electroporación (Cuvette Gene Pulser de Biorad, cat. 165-2088). Las células se sometieron a electroporación colocando la cubeta en el soporte de electroporación del Biorad GenePulser (cat. 165-2076). Ajustes utilizados: 250 V, 500 μF, la constante de tiempo debe estar entre 5.6 y 7.5. Las células sometidas a electroporación se recuperaron suavemente de las cubetas y se colocaron en placas. La selección de antibióticos comenzó 24 horas después de la electroporación.

Extracción de ADN genómico y Splinkerette-PCR

Las células se recogieron y se incubaron durante la noche a 56 °C con tampón de lisis [Tris-HCl 10 mM, pH 7.5; EDTA 10 mM; NaCl 10 mM; Sarcosyl al 0.5% p/v, suplementado con proteinasa K (Sigma, cat. P2308) hasta una concentración final de 1 mg/mL]. Para obtener precipitados de ADN, al día siguiente se añadieron 2 mL de una mezcla de NaCl y etanol (30 µL de NaCl 5 M mezclados con 20 mL de etanol absoluto frío). Los extractos celulares se centrifugaron durante 45 minutos a 4 °C para eliminar la fracción soluble. El ADNg precipitado se enjuagó tres veces goteando 2 ml de etanol al 70 % y finalmente se resuspendió en agua miliQ a 70 °C.

El procedimiento Splinkerette-PCR para el mapeo de integración de PB se adaptó de Potter y Luo ¹³⁹ y consistió en los siguientes pasos: a) Se digirieron 2 μg de ADN genómico con 10 U de BstYI (10,000 U/mL, NEB) en un volumen de 30 μL. La reacción se incubó a 60 °C durante la noche, al día siguiente se inactivó la enzima a 80 °C durante 20 minutos. Los adaptadores para Splinkerette-PCR se generaron mediante la hibridación de 150 pmol de los cebadores AdapterA y B (Tabla complementaria 1) en un volumen final de 100 μL (10x NEB Buffer 2). Los oligos se desnaturalizaron a 65 °C durante 5 min y luego se enfriaron; b) La ligadura se realizó en un volumen total de 6 μl, incluida una mezcla de ligadura 2x (Takara), 2.5 μl de gDNA digerido y 0.5 μl de adaptadores recocidos para Splinkerette-PCR. La reacción de ligación se incubó a 16 °C durante la noche, al día siguiente a 65 °C durante 10 minutos para la inactivación de la enzima. Se incluyó un paso de purificación antes del paso C, utilizando el kit de purificación QIaquick PCR, siguiendo las instrucciones del fabricante. Para las amplificaciones por PCR, utilizamos Phusion HF DNA Pol (NEB) en 5x Phusion GC Buffer recomendado en caso de plantillas ricas en GC o aquellas con estructuras secundarias. La mezcla de PCR incluía tampón GC 5x, dNTP 10 mM, DMSO y Phusion Pol; c) La primera ronda de PCR se amplificó con 15 μL de ADN ligado (o 50 % del producto de ligación para cada reacción para las uniones de transposón/huésped PB5' y PB3'), 0.5 μM para cada cebador (Adaptor-PCR1 y PB5' o PB3' -ITR PCR1), mezcla de PCR de 6.5 μL, volumen final de 25 μL. Programa Splinkerette-PCR1: 95 °C durante 2 minutos; dos ciclos de 95 °C por 20 segundos, 65 °C por 30 segundos, 68 °C por 2 minutos; luego 30 ciclos de 95 °C por 30 segundos, 60 °C por 30 segundos, 68 °C por 2 minutos; luego 68 °C por 10 minutos; d) Para la segunda ronda de PCR, usamos 5 μL de dilución 1:500 del producto PCR1, 0.5 μM para cada cebador (Adapter-PCR2 y PB5' o PB3'-ITR PCR2), 6.5 μL de mezcla de PCR, volumen final de 25 μL . Programa Splinkerette-PCR2: 95 °C durante 2 minutos; dos ciclos de 95 °C por 20 segundos, 65 °C por 30 segundos, 68 °C por 2 minutos; luego 5 ciclos de 95 °C por 30 segundos, 60 °C por 30 segundos, 68 °C por 2 minutos; luego 25 ciclos de 95 °C por 30 segundos, 58 °C por 30 segundos, 68 °C por 2 minutos; luego 68 °C por 10 minutos; e) Los productos de PCR2 se trataron con fosfatasa antártica y exonucleasa I (ambas de NEB) y se secuenciaron usando cebadores PB5'- o PB3'-ITR PCR2. Los cebadores y las secuencias de adaptadores se enumeran en la Tabla complementaria 1.

Análisis de secuenciación de próxima generación de sitios de integración genómica

El ADN genómico de poblaciones enteras de mutantes se extrajo utilizando un Gentra Puregene Cell Kit. La preparación y secuenciación de la biblioteca se realizó como se describió anteriormente.¹⁴⁰. Una tubería de bioinformática a medida permitió mapear cada lectura individual a un locus genómico y asociar cada sitio de integración a un gen dentro de los 20 kb de distancia. Luego, los datos se organizaron en la red de genes que interactúan con HD por medio del software Cytoscape (v3.8.2)¹⁴¹.

Tinción con yoduro de propidio (PI)

La tinción con PI se realizó en ESC de un solo ratón vivo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Ebioscience, cat. 88-8007-72). Después de lavar en PBS, 10⁵ las células vivas se resuspendieron en 200 μl de tampón de unión 1x y se añadieron 5 μl de solución de tinción PI (cat. 00-6990). El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando un BD FACSCanto^TM II citómetro dentro de 1 hora, almacenando muestras a 2-8 °C en la oscuridad. Los datos se analizaron con BD FACSDiva^TM (v. 9.0) y software FlowJo (10.8.1). La estrategia de activación representativa está disponible en la figura complementaria. 10a.

Ensayo de medición de ROS

La producción de ROS se detectó mediante la tinción de ESC de ratón vivo único y células NPC humanas con diacetato de 2 ', 7'-diclorodihidrofluoresceína (H₂DCFDA; Tecnologías de la vida, gato. D399), realizando los siguientes pasos: a) el indicador ROS se reconstituyó recientemente para hacer una solución madre concentrada (10 mM); b) 3-5×10⁵ se recolectaron las células, c) se lavaron una vez con 500 μL de PBS yd) se resuspendieron en 300 μL de PBS que contenían la sonda para proporcionar una concentración de trabajo final de 0.5 μM de colorante; e) las células se incubaron a 37 °C durante 10 minutos en la oscuridad; f) después de eliminar la solución de tinción, las muestras g) se lavaron dos veces en PBS. Las muestras se recogieron por citometría de flujo utilizando un BD FACSCanto^TM II citómetro o BIO-RAD S3e Cell Sorter y el análisis se realizó con BD FACSDiva^TM (v. 9.0), ProSort^TM (v. 1.6) y software FlowJo (10.8.1). La estrategia de activación representativa está disponible en la figura complementaria. 10b-c.

Tinción de anexina V

Los NPC vivos, transfectados transitoriamente con el gen de interés y tratados con rotenona 30 μM durante 24 horas, se tiñeron con anexina V según las instrucciones del fabricante (Ebioscience, cat. 88-8007-72). Las células se lavaron una vez en PBS, luego una vez en tampón de unión 1x (cat. 00-0055). 5×10⁵ las células se resuspendieron en 200 μl de tampón de unión 1x y se incubaron con 5 μl de anexina V conjugada con fluorocromo (cat. 17-8007) durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las células se lavaron en 500 μl de tampón de unión 1x. Finalmente, las células se resuspendieron en 200 μL de 1x Binding Buffer. El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando el clasificador de células BIO-RAD S3e en 1 hora, almacenando las muestras a 2-8 °C en la oscuridad. Los datos fueron analizados con ProSort^TM (v. 1.6) y software FlowJo (10.8.1). La estrategia de activación representativa está disponible en la figura complementaria. 10c.

Western Blot

Las células se lavaron en PBS frío y se recolectaron en tampón de lisis (Hepes 50 mM, pH 7.8, NaCl 200 mM, EDTA 5 mM, NP1 al 40 %, glicerol al 5 %), complementado recientemente con DTT 1 mM, inhibidor de proteasa (Roche, cat. 39802300) e inhibidor de fosfatasa (Sigma-Aldrich, cat. P5726). Las muestras se expusieron a ultrasonidos en un sonicador (Diagenode Bioruptor) y se centrifugaron a 15,871 rcf durante 10 minutos para preparar el sobrenadante. La concentración de proteína se determinó por cuantificación de Bradford. Para los experimentos en las Figs. 1b, 2g, 4d y Fig. Suplementaria. 1d, la proteína total (10 µg) se fraccionó en gel de acrilamida Nupage MOPS al 4-12 % (Life Technologies, cat. BG04125BOX/BG00105BOX) y se transfirió electroforéticamente en una membrana de PVDF (Millipore, cat. IPFL00010) en una solución de transferencia (50 mM Tris -HCl, glicina 40 mM, metanol al 20 %, SDS al 0.04 %). A continuación, las membranas se saturaron con leche en polvo sin grasa al 5 % (BioRad; 170-6405-MSDS) en TBST (8 g de NaCl, 2.4 g de Tris-HCl, 0.1 % de Tween20/litro, pH 7.5) durante 1 hora a temperatura ambiente. y se incubó durante la noche a 4 ° C con anticuerpo primario anti-HTT (clon 1HU-4C8) o anti-GAPDH (clon 6C5) (Tabla complementaria 2). Luego, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa, diluidos en leche al 1% en TBST. Se utilizó el reactivo quimioluminiscente Pico SuperSignal West (Thermo Scientific, cat. 34078) para incubar las membranas y las imágenes se adquirieron digitalmente mediante ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare). Los geles sin recortar y los valores numéricos se proporcionan en el archivo de datos de origen.

Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical y los tejidos se homogeneizaron en tampón de lisis que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 7.4, Nonidet P-1 al 40 %, EDTA 1 mM, NaF 20 mM, Na 2 mM₃VO₄ y mezcla inhibidora de proteasa 1:1000 (Sigma-Aldrich) y sonicada. Para el experimento en la Fig. Suplementaria. 1b, 50 µg de lisado de proteína total de ratón WT, ratón R6/2, células Q15 y células Q128 se cargaron en un gel de apilamiento de acrilamida al 5-11% moldeado a mano y se incubaron con los siguientes anticuerpos: anti-HTT (clon EM48) y anti -GAPDH (Tabla Complementaria 2). Para los experimentos en la Fig. Suplementaria. 8a, d, e y g, 40 µg de lisado de proteína total se inmunotransfirieron con los siguientes anticuerpos: anti-GFP, anti-ACTINA (clon 8H10D10), anti-HTT (clon EM48), anti-TUBULIN (clon B-5-1-2) (Tabla complementaria 2). Las membranas se procesaron como se describe anteriormente. Las imágenes fueron adquiridas digitalmente por VWR Imager CHEMI Premium o ChemiDoc XRS+ (modelo n°: Universal Hood II) con Image Lab Software, BioRad (v. 6.1). La cuantificación se realizó utilizando Fiji 2.9.0 con sustracción de fondo y normalización en el control de carga (GAPDH, ACTIN o TUBULIN). Los geles sin recortar se proporcionan en los archivos de datos de origen.

Inmunofluorescencia

La inmunofluorescencia para la detección de MTF1 en ESC de ratón se realizó en células sembradas en cubreobjetos de vidrio recubiertos con fibronectina (Merck, cat. FC010). Las células se fijaron en formaldehído al 4 % (Sigma-Aldrich, cat. F8775) en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente, se lavaron en PBS, se permeabilizaron durante 10 minutos en PBS + 0.1 % Triton X-100 (PBST) a temperatura ambiente y se bloquearon. en PBST + 3% de suero de caballo (HS; Gibco, cat. 16050-122) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las células se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios (para obtener detalles sobre los anticuerpos primarios y secundarios, consulte la Tabla complementaria 2) en PBST + 3% de HS. Después de lavar con PBST, las células se incubaron con anticuerpos secundarios (Alexa, Life Technologies) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Los núcleos se tiñeron con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol; Sigma-Aldrich, cat. F6057). Las imágenes se adquirieron con microscopios confocales Leica SP5. El análisis de imágenes se realizó con Fiji 2.9.0. La cuantificación de la intensidad nuclear y citoplasmática se realizó con el software CellProfiler (v4.1.3). Brevemente, los núcleos se detectaron mediante tinción con DAPI. El citoplasma se definió arbitrariamente mediante núcleos que se expandían radialmente en 10 píxeles. Se calculó y representó la relación de la intensidad nuclear integrada de la señal de MTF1 sobre la intensidad integrada celular de la señal de MTF1 (núcleo + citoplasma).

El análisis de inmunofluorescencia en iPSC y NPC humanos se realizó en cubreobjetos de vidrio recubiertos con Matrigel al 1 % en pocillos. Las células se fijaron en formaldehído al 4 % (Sigma-Aldrich, cat. F8775) en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente, se lavaron en PBS, se permeabilizaron durante 1 hora en PBST a temperatura ambiente y se bloquearon en PBST + HS al 5 % (Gibco, cat. 16050-122) durante 5 horas a temperatura ambiente. Las células se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios (para obtener detalles sobre los anticuerpos primarios y secundarios, consulte la Tabla complementaria 2) en PBST + 3% de HS. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con anticuerpos secundarios (Alexa, Life Technologies) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Los núcleos se tiñeron con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol; Sigma-Aldrich, cat. F6057). Las imágenes se adquirieron con microscopios confocales Zeiss LSM900 Airyscan 2. El análisis de imágenes se realizó con Fiji 2.9.0.

Aislamiento de ARN, transcripción inversa y PCR cuantitativa

Para el lisado celular, se aisló el ARN usando el kit de purificación de ARN total (Norgen Biotek, cat. 37500) y se hizo ADN complementario (ADNc) a partir de 500 ng usando transcriptasa inversa M-MLV (Invitrogen, cat. 28025-013), RNaseOUT (40 unidades/µl), cebadores aleatorios (200 nM), dNTP (10 mM), tampón de primera cadena 5x, DTT (0.1 M). Para las larvas de pez cebra, se aisló el ARN total aprovechando la extracción con fenol-cloroformo. El ARN total se aisló de grupos de 10 animales utilizando el reactivo TRIzol (Life Technologies, cat. 15596026), siguiendo las instrucciones del fabricante para el procedimiento estándar de extracción con trizol-cloroformo-etanol. Se usó glucógeno libre de ARNasa como sugiere el protocolo, para aumentar el rendimiento del paso de precipitación de ARN. Se transcribieron de forma inversa 2 μg de ARN total en ADNc mediante el uso de transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen, cat. 18080044) y una mezcla de cebadores oligo(dT)18 (500 μg/ml); mezcla de dNTP (10 mM); TDT (0.1M); 5 tampones de primera hebra; RNaseOUT (40 unidades/μL).

Para la PCR en tiempo real, se utilizó SYBR Green Master mix (Bioline, cat. BIO-94020). Los cebadores se detallan en la tabla complementaria 3. Se realizaron réplicas técnicas para todas las PCR cuantitativas. Para ESC de ratón, iPSC y NPC humanos, Gapdh y GAPDH se usaron como control endógeno para normalizar la expresión. La media Ct del pez cebra brechadh, eef1a1l1, tuba1b y b2m se usó como un control interno endógeno para la normalización, debido a la variabilidad que se muestra al observar los niveles de expresión de esos genes. Los datos de qPCR se adquirieron con QuantStudio™ 6&7 Flex Software 1.0 y 1.3 versión.

Secuenciación de ARN: preparación de bibliotecas

El ARN total se cuantificó mediante el ensayo fluorimétrico Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Se prepararon bibliotecas a partir de 125 ng de ARN total utilizando el servicio de secuenciación de grado de investigación NEGEDIA Digital mRNA-seq (Negedia srl)¹⁴⁰ que incluyó la preparación de bibliotecas, la evaluación de la calidad y la secuenciación en un sistema de secuenciación NovaSeq 6000 utilizando una estrategia de 100 ciclos de un solo extremo (Illumina Inc.).

Flujo de trabajo de bioinformática

Los datos sin procesar fueron analizados por NEGEDIA Digital mRNA-seq, propiedad de Next Generation Diagnostics srl, que implica un paso de limpieza mediante filtrado y recorte de calidad, alineación con el genoma de referencia y conteo por gen.^142,143. Los genes se clasificaron eliminando aquellos que tenían un número total de recuentos por debajo de 5 en al menos 3 muestras de 30. Después de aplicar este filtro, identificamos 11,851 XNUMX genes expresados ​​que se consideraron para análisis posteriores.

El análisis de expresión diferencial se llevó a cabo en el entorno R (v. 4.1.0) con Bioconductor (v. 3.14) explotando el paquete DESeq2 R. (v.1.34.0)¹⁴⁴ y edgeR (versión 3.36.0)¹⁴⁵. DESeq2 realiza la estimación de factores de tamaño, la estimación de dispersión para cada gen y ajusta un modelo lineal generalizado binomial negativo con estadísticas de Wald de dos colas. Importancia biológica de los DEG entre Q128 y Q15 (Fig. 1g), de DEG entre Q128_Mtf1 y Q128 (Fig. 5b) y de genes rescatados por mtf1 (Higo. 5c) fue explorado por el análisis de enriquecimiento de términos de Gene Ontology (GO) usando el software Enrichr (v. 3.0) e incluyendo las categorías de Procesos Biológicos (BP) (2021) y Función Molecular (MF) (2021).

Para realizar el enriquecimiento de la proliferación de la población celular (GO:0008283 y¹⁴⁶) y firmas genéticas de apoptosis (R-HSA-109581 y WP1351) en líneas celulares Q128 y Q15 que sobreexpresan mtf1, utilizamos el software Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) (v 4.3.2)¹⁴⁷. Las listas de conjuntos de genes preclasificados se generaron en función del registro₂ valores de cambio de pliegue (FC) obtenidos por el análisis de expresión diferencial entre Q128_Mtf1 frente a Q128 y Q15_Mtf1 frente a Q15.

El análisis de enriquecimiento de Motif se realizó utilizando la herramienta Motif Analysis de la suite Regulatory Genomics Toolbox (https://reg-gen.readthedocs.io). Mtf1 MRE se obtuvo de la base de datos Jaspar (novena versión, http://jaspar.genereg.net/)¹⁴⁸. Se utilizó el comando “rgt-motifanalysis matching” para buscar sitios de unión en la región promotora de todos los genes de interés; luego, se usó el "enriquecimiento de análisis de motivos rgt" para realizar una prueba exacta de Fisher para evaluar si la proporción de sitios de unión en el conjunto de genes de interés es mayor de lo esperado por casualidad.

Una réplica biológica representativa de los datos de secuenciación de ARN y Mtf1 MRE se visualizaron como pistas en Integrated Genomics Viewer (IGV v. 2.16.0) y se muestran en la Fig. 5h.

Los diagramas de volcanes y los diagramas de dispersión se produjeron con log₂ FC y registro₁₀ p-value explotando la función ggscatter del paquete ggpubr R (v. 0.4.0.5). Los mapas de calor se crearon utilizando valores de CPM con la función pheatmap del paquete pheatmap R (v. 1.0.12).

Alineación de ortólogos Mtf1

El mtf1 La alineación de secuencias se realizó utilizando el software Clustal Omega (v1.2.4, https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)¹⁴⁹. La identidad entre las secuencias se calculó utilizando el programa Sequence Manipulation Suite (https://www.bioinformatics.org/sms2/ident_sim.html).

Análisis de metales

Después de un tratamiento acondicionador de 48 horas, 10⁷ Se recolectaron las células Q15 y Q128, se centrifugaron en tubos Eppendorf, se eliminó el sobrenadante y los sedimentos celulares se almacenaron a -80 °C. Inmediatamente antes del análisis, las células se descongelaron y se resuspendieron en HNO concentrado.₃ (68%), se agregó 1 mL a cada muestra. Después de la disolución completa, agregamos 2 ml de agua ultrapura y mineralizamos completamente la muestra por medio de calentamiento por microondas, utilizando un reactor de microondas de alta presión y alta eficiencia (Ultrawave, Milestone, Bergamo, Italia). El mismo procedimiento se aplicó al medio de cultivo, antes y después del tratamiento de acondicionamiento. Las curvas de calibración para la cuantificación de metales se obtuvieron mediante la preparación de seis soluciones estándar a diferentes concentraciones (0.005-0.010-0.025-0.050-0.100-0.200 ppm), haciendo uso de estándares certificados multielemento y monoelemento (Agilent). A continuación, todas las muestras se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0.20 µm. El análisis de metales, con la atomización e ionización de las muestras obtenidas en un plasma de Argón, se realizó mediante Espectrometría de Emisión Óptica de Plasma Acoplado Inductivamente (ICP-OES, mod 5110, Agilent).

Generación del modelo Zebrafish HD

El pez cebra HD se generó mediante microinyección en embriones en etapa unicelular de ARNm que codifica el primer exón de humano HTT incluyendo 74Q o 16Q, fusionado en marco con la secuencia de codificación eGFP. Q74eGFP y Q16eGFP se clonaron en el plásmido pCS2+ para permitir la transcripción in vitro. También se generaron plásmidos pCS2_Mtf1 y pCS2_mCherry para obtener mtf1 y cereza ARNm utilizados para inyecciones en embriones de pez cebra HD.

Para la transcripción in vitro de ARN, se linealizaron 2.5 μg de pCS2_Q74eGFP, pCS2_Q16eGFP, pCS2_Mtf1 y pCS2_mCherry mediante digestión durante la noche a 37 °C con HF-Not I (New England Biolabs, cat. R3189S). Luego, el volumen de digestión se concentró con el kit DNA Clean & Concentrator (Zymo Research, cat. D4003) y se usó para la reacción de transcripción protegida (mMESSAGE mMACHINETM SP6 Transcription Kit, Thermo Fisher Scientific, cat. AM1340) por SP6 RNA polimerasa. Después de eliminar la plantilla de ADN mediante el tratamiento con ADNasa (Thermo Fisher Scientific, cat. AM2238) durante 15 minutos a 37 °C, el ARN se purificó mediante extracción con fenol-cloroformo (como se explica en el párrafo "Aislamiento de ARN, transcripción inversa y PCR cuantitativa"). El ARN se cuantificó mediante Nanodrop ND-1000 y luego se diluyó según la necesidad en una mezcla de tampón Danieau al 10 % [NaCl 8 mM, KCl 0.7 mM, MgSO 0.4 mM₄, 0.6 mM Ca(NO₃)₂, HEPES 2.5 mM, pH 7.6], rojo fenol al 10% (Merck, cat. 1072410025) y agua libre de ARNasa.

Para seleccionar la dosis de inyección que causó la tasa más alta de malformaciones con el nivel más bajo de muerte, inyectamos dosis crecientes de ARNm de Q74eGFP que oscilaron entre 150 y 1000 pg/embrión y puntuamos fenotípicamente 24 embriones hpf. Una vez establecida la dosis de 250 pg/embrión, bajo un microscopio óptico, se inyectaron los ARNm transcritos in vitro a los embriones. A continuación, los embriones microinyectados se transfirieron a agua de pescado y se incubaron a 28 °C. Los huevos no fertilizados fueron reconocidos y descartados 4 horas después de la microinyección. Se decoronaron renacuajos de 24 hpf usando agujas dedicadas bajo un microscopio óptico.

Tinciones de montaje completo

Los embriones inyectados se anestesiaron con tricaína y se inmovilizaron en metilcelulosa al 1.5 % o agarosa de bajo punto de fusión al 2 % y se analizaron con un microscopio de fluorescencia Leica M165FC. Las imágenes de pez cebra confocal se adquirieron con un microscopio confocal Nikon C2 H600L.

Para la tinción in vivo con sal de naranja de acridina hemi (cloruro de zinc) (Merck, cat. A6014), se decorionaron 24 embriones hpf, se transfirieron a una placa de 6 pocillos y se incubaron en aproximadamente 2 ml de naranja de acridina (20 μg/ml) por pocillo en agua de pescado durante 15 minutos a 28 °C. A continuación, se eliminó la solución de acridina y los embriones se lavaron tres veces con 1 ml de agua de pescado. Antes de ser observados en un portaobjetos de vidrio con un microscopio de fluorescencia, los renacuajos fueron anestesiados con Tricaine.

Para el ensayo TUNEL, se utilizaron el kit de detección de apoptosis in situ con fluoresceína ApopTag (Merck, cat. S7110) y colagenasa (Merck, cat. C9891). Se colocaron 7 embriones, 30 horas después de la microinyección por condición, en un Eppendorf, se anestesiaron con Tricaína y se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4 % a 4 °C durante la noche. Luego, se eliminó el PFA y las muestras se lavaron con PBS (3 veces, 10 minutos cada una), mientras se agitaba. Los embriones se deshidrataron a través de una serie de soluciones de metanol que oscilaban entre el 10 % y el 100 % y se congelaron a -20 °C durante la noche. Luego, los embriones se rehidrataron con una serie de soluciones de metanol al 70-50-30% y se lavaron con PBS con Tween-20 durante 10 minutos, mientras se agitaban. Después de eso, se aplicó colagenasa durante 8 minutos mientras se agitaba y el exceso se lavó mediante PBS con pasos de lavado Tween-20 (3 veces, 5 minutos cada una). Las muestras se incubaron durante 1 hora en el tampón de equilibrio mientras se agitaban, luego durante 2 horas a 37 °C en la fuerza de trabajo TdT. La reacción se detuvo lavando dos veces las muestras en el tampón Stop/Wash de concentración de trabajo. A continuación, hubo un paso de bloqueo de 1 hora con PBS con Tween-20 mientras se agitaba, y luego los embriones se incubaron durante la noche en una solución conjugada de anti-digoxigenina de fuerza de trabajo a 4 °C en la oscuridad. A la mañana siguiente, se retiró la solución de anticuerpos, se lavaron las muestras con PBS (4 veces, 10 minutos cada una) y se analizaron con un microscopio confocal. Las estructuras anteriores de las larvas de pez cebra se escanearon en 70 pilas de 3.475 μm cada una, abarcando toda su profundidad. Cuantificamos las fracciones del área positiva fluorescente sobre el área total (excluyendo la región de la yema). Para los análisis de cuantificación, todas las imágenes se adquirieron con los mismos parámetros de exposición y se procesaron con el software Fiji (v2.9.0). Los análisis estadísticos se realizaron con Past (v.4.03) y Prism (v.9.5.0).

Inyección de vector AAV-PHP.eB, fenotipado de ratón y recolección de tejido

Las partículas virales AAV-PHP.eB se produjeron y valoraron en el laboratorio de Broccoli como se describió anteriormente.⁷⁵. Este vector viral fue modificado para expresar bajo el control del promotor Ef-1ɑ el gen candidato mtf1 o eGFP como control. La inyección vascular se realizó en un limitador que colocó la cola en un surco calentado. La cola se limpió con alcohol y luego se inyectó por vía intravenosa. Los ratones WT y R6/2 se aleatorizaron en grupos y se inyectaron en la vena de la cola a las 4.2 semanas de edad. Después de la inyección, se pesaron todos los ratones dos veces por semana. Se realizó el fenotipado, ciego al genotipo y al tratamiento, dos veces por semana. El equilibrio y la coordinación motora fueron evaluados por la prueba de Rotarod y la Tarea de Escalera Horizontal. El ADN total se aisló de tejidos animales (corteza y cuerpo estriado) utilizando los kits de sangre y tejidos Qiagen DNeasy (QIAGEN, cat. 9504).

La cría de animales

Todos los experimentos con pez cebra se llevaron a cabo en las instalaciones de peces del Departamento de Biología de la Universidad de Padua. Las larvas de pez cebra se mantuvieron como máximo tres días en cajas Petri con agua de pescado (60 mg de Instant Ocean, cat. SS15-10, por litro de agua destilada) a pH neutro a 28 °C, según procedimientos estándar (http://ZFIN.org).

Se establecieron colonias de ratones en IRCCS Neuromed. Parejas reproductoras de la línea R6/2 de ratones hembra transgénicos [nombre de la cepa: B6CBA-tgN (HDexon1) 62Gpb/1 J] con ~Se compraron 160 ± 10 expansiones de repetición CAG de Jackson Laboratories. Los ratones se alojaron en condiciones estándar (22 ± 1 °C, 60 % de humedad relativa, horario de 12 h de luz/oscuridad, 3–4 ratones/jaula, con libre acceso a comida y agua). Se cruzaron ratones R6/2 macho (5-6 semanas de edad) con ratones B6CBA WT hembra (5-6 semanas de edad) para el mantenimiento de colonias; los ratones WT y R6/2 resultantes se usaron para todos los experimentos realizados en este estudio. En la Tabla complementaria se incluye una lista completa de los ratones utilizados en este estudio, que indica la edad, el sexo, los tratamientos y las medidas. 4. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el comité de ética de la Junta de Revisión de Cuidado Animal Neuromed del IRCCS y por el Istituto Superiore di Sanità (número de permiso ISS: 548/2022-PR) y se realizaron de acuerdo con la directiva 2010/63/EU para experimentos con animales.

Pruebas de comportamiento motor

Todas las pruebas de comportamiento se realizaron durante la fase de luz del ciclo luz/oscuridad. Los ratones se probaron antes y después del tratamiento en los puntos de tiempo indicados. Antes del entrenamiento y las pruebas, los ratones pasaron por un período de habituación a la sala de pruebas y al equipo. Todos los ratones recibieron entrenamiento durante dos días consecutivos en cada instrumento y tarea antes de realizar las mediciones del comportamiento motor. Los ratones se probaron a velocidad fija (0.1 rcf) en un aparato rotarod durante 1 min. Cada ratón se probó en tres ensayos consecutivos de 1 min cada uno, con 1 min de descanso entre ensayos. Se promedió el tiempo empleado en el rotarod en cada uno de los tres ensayos para dar el tiempo total de cada ratón. En la tarea de la escalera horizontal, los ratones caminaron espontáneamente a lo largo de una escalera horizontal con espaciado variable e irregular entre los peldaños. En cada sesión de prueba, se evaluó el rendimiento del ratón utilizando un sistema de puntuación de pisadas establecido.¹⁵⁰, que permite la evaluación cualitativa y cuantitativa de la ubicación de las extremidades anteriores y posteriores en los peldaños de la escalera. Todas las pruebas motoras fueron realizadas por el mismo experimentador que desconocía el genotipo del ratón y el grupo experimental durante todo el curso del análisis.

Análisis de cierre

La puntuación de cierre se determina durante 30 segundos. En particular, los ratones fueron suspendidos por la cola desde una altura de 50 cm y se definió una respuesta de agarre de extremidades como la retirada de cualquier extremidad hacia el torso durante más de 2 segundos. Se utilizaron las siguientes puntuaciones: 0 (ausencia de unión), 0.5 (retirada de cualquier extremidad), 1 (retirada de dos extremidades), 1.5 (retirada de tres extremidades), 2 (retirada de las cuatro extremidades).

Dihidroetidio (DHE)

Se sacrificaron ratones WT y R6/2 por dislocación cervical. Se extrajeron y recortaron los cerebros extrayendo los bulbos olfativos y la médula espinal. El cerebro restante se procesó y se incrustó en cera de parafina, se cortaron secciones coronales de 10 µm en un micrótomo RM 2245 (Leica Microsystems) y se flotó en un baño de agua a 40 °C que contenía agua destilada. Las secciones se transfirieron a portaobjetos de vidrio adecuados para inmunohistoquímica y se dejaron secar durante la noche a temperatura ambiente. Las muestras se desparafinaron en xileno durante 30 minutos, se transfirieron a alcohol al 100 % durante 10 minutos y luego una vez a alcohol al 95 %, 70 % y 50 % respectivamente durante 10 minutos cada una, se lavaron dos veces en PBS. La producción de generación de superóxido in situ se detectó mediante fluorescencia con DHE (Sigma-Aldrich, cat. D7008). Las muestras se incubaron con DHE (2 µM) en una cámara humidificada protegida de la luz a 37 °C durante 30 minutos. Los portaobjetos se enjuagaron dos veces con PBS y se observaron al microscopio. Para cada tinción, se usaron cuatro ratones por grupo experimental y se adquirieron tres secciones coronales para cada animal con el microscopio Nikon ECLIPSE Ni y se analizaron con NIS-Elements Image Software (v. 4.40, Nikon) y el software Fiji 2.9.0.

inmunotinción de agregados mHTT

Se sacrificaron ratones WT y R6/2 por dislocación cervical. Los cerebros se extrajeron y recortaron extrayendo los bulbos olfativos y la médula espinal. El cerebro restante se procesó y se incrustó en cera de parafina, se cortaron secciones coronales de 10 µm en un micrótomo RM 2245 (Leica Microsystems) y se flotó en un baño de agua a 40 °C que contenía agua destilada. Las secciones se transfirieron a portaobjetos de vidrio adecuados para inmunohistoquímica y se dejaron secar durante la noche a temperatura ambiente. Las muestras se desparafinaron en xileno durante 30 minutos, se transfirieron a alcohol al 100 % durante 10 minutos y luego una vez a alcohol al 95 %, 70 % y 50 % respectivamente durante 10 minutos cada una, se lavaron dos veces en PBS. Para desenmascarar el epítopo antigénico, la recuperación del antígeno se realizó mediante el método de tampón de citrato (incube con tampón de citrato 10 mM, pH 6.0 a 95-100 °C durante 15 minutos y luego deje que los portaobjetos se enfríen durante 15 minutos). Los portaobjetos se lavaron dos veces con PBS, se permeabilizaron en TBS-Triton al 0.1 % durante 10 minutos y luego se incubaron en una cámara humidificada a temperatura ambiente con tampón de bloqueo (suero de caballo al 10 % en PBS) durante 1 hora. Se eliminó el tampón de bloqueo y se incubaron los portaobjetos en una cámara humidificada a 4 °C durante la noche usando un anticuerpo anti-HTT de ratón (clon EM48, para obtener detalles, consulte la Tabla complementaria 2). Después de lavar tres veces con PBS, las células se incubaron con anticuerpos secundarios durante 1 h en una cámara húmeda a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Los núcleos se tiñeron con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol; Sigma-Aldrich, cat. F6057). Se usaron cuatro ratones por grupo experimental y se adquirieron tres secciones coronales para cada animal con el microscopio Nikon ECLIPSE Ni y se analizaron con NIS-Elements Image Software (v. 4.40, Nikon) y el software Fiji 2.9.0.

Estadística y reproducibilidad

No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra, pero nuestros tamaños de muestra son similares a los que se usan comúnmente en nuestro campo de investigación. No se excluyeron datos de los análisis. Se asumió que la distribución de datos era normal, pero esto no se probó formalmente. P-valores para experimentos que involucran medidas repetidas (Fig. 1c, Higo. 4f, Higo. 7b (Izquierda), 7c (izquierda) y 7g, Higo. 8d, f, Fig. Suplementaria 1e, Fig. Suplementaria 4a,c, Fig. Suplementaria 8c, Fig. Suplementaria 9c) se calcularon con ANOVA de medidas repetidas de dos vías con la corrección de Bonferroni. Para experimentos con líneas celulares, asignamos aleatoriamente una fracción de cada población celular a diferentes réplicas biológicas. Para el análisis de datos de inmunotinción y citometría de flujo, analizamos campos aleatorios o fracciones aleatorias de células. Otros tipos de experimentos no fueron aleatorios. La recopilación y el análisis de datos no se realizaron a ciegas de las condiciones de los experimentos, pero los análisis de datos se realizaron con parámetros y software idénticos. El análisis de los comportamientos motores de los ratones se realizó a ciegas. La representación de datos y los análisis estadísticos se realizaron con el software R (v. 4.0.0 y v. 4.1.0) y PAST (v4.03), a menos que se indique lo contrario. Todas las barras, barras de error y diagramas de caja se definen en las leyendas de las figuras. El número de réplicas biológicas y experimentos independientes, ambos >2, se indica en las leyendas de las figuras. Las pruebas estadísticas utilizadas se indican en las leyendas de las figuras. Todos los experimentos de qPCR se realizaron con tres réplicas técnicas. Dos operadores independientes han obtenido resultados experimentales clave.

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de la cartera de naturaleza vinculado a este artículo.

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41467-023-39552-9