Líneas celulares

Se obtuvieron y cultivaron células de cáncer de vejiga humana y murina SV-HUC-1, RT4, UM-UC-3, T24, 5637, MB49 como se describió anteriormente [44]. Para inducir células T24, UMUC-3 y MB49 resistentes al cisplatino, las células se cultivaron en un medio que contenía cisplatino y la concentración de cisplatino aumentó de 1 μM a 25 μM durante 10 meses.

Microarrays de tejidos y muestras de pacientes.

El microarray de tejido de cohorte de Huashan está compuesto por 90 pares de tejidos normales y malignos que recibieron cistectomía radical con cáncer de vejiga, entre 2007-01 y 2013-01, con un seguimiento de 5 años.44].

El microarray de tejido utilizado en este estudio provino de 90 casos de cáncer de vejiga que recibieron cistectomía radical en nuestro centro desde enero de 2007 hasta enero de 2013. Los criterios de inclusión y exclusión son los siguientes:

1. 1.

   Criterios de inclusión:

1. a.

   En nuestro centro se realizó cistectomía radical y se encuentran disponibles muestras patológicas completas. Dos patólogos confirmaron que la muestra patológica era cáncer de vejiga. La muestra contiene tumores y tejidos normales.

2. b.

   Edad: 18-80 años

1. 2.

   Criterio de exclusión:

1. a.

   La información clínica del paciente está incompleta.

2. b.

   La calidad de las muestras patológicas no está calificada.

3. c.

   Tener antecedentes de terapia de perfusión vesical dentro de los 3 meses anteriores a la cirugía o recibir quimioterapia/radioterapia adyuvante dentro de los 6 meses anteriores a la cirugía.

Se obtuvo el consentimiento por escrito de los pacientes y fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Huashan (número de aprobación KY2011-009, 2022-100). También se recogieron muestras del paciente para la secuenciación de circRNA y el análisis de expresión mediante el mismo procedimiento.

Análisis metabolómico

Se utilizaron células T24/T24-CR y células T24-CR-LV-NC/T24-CR-LV-circARHGAP10OE para el análisis metabolómico. El medio se descartó después de alcanzar la confluencia y las células se lavaron con PBS 3 veces. Las células se rasparon en 2 ml de metanol enfriado y se lisaron para extraer los metabolitos como se describió anteriormente.44].

Análisis proteómico

Se separaron 20 µg de proteína extraída mediante SDS-PAGE. La proteína se digirió con tripsina y se realizó LC-MS/MS con una espectrometría timsTOF-Pro acoplada a Nanoelute (Bruker). Se buscaron datos de proteínas crudas con el software MaxQuant 1.6.14 para el análisis de cuantificación. Después de los pasos de anotación, las proteínas fueron destruidas para recuperar sus identificaciones KEGG. El análisis metabolómico y proteómico y el análisis multiómico integrado de este trabajo se completaron en Applied Protein Technology, Shanghai, China.

Secuencia de ARN

Se extrajo ARN de cinco pares de tejidos de vejiga benignos y malignos con TRIzol (Invitrogen, EE. UU.). Se extrajeron 3 mg de ARN total y se secuenciaron adicionalmente como se describió anteriormente [41].

ARN FISH e inmunofluorescencia.

Se sintetizaron sondas dirigidas al sitio de unión de circARHGAP10 (GenePharma Biotech, Guangzhou, China). El IF y el procedimiento fotografiado se realizaron como se describió anteriormente [41]. Todas las células se fijaron y marcaron con DAPI y las células se fotografiaron con el microscopio confocal LSM700 (Carl Zeiss, Oberkochen).

Tratamiento con ARNasa R

El ARN total se extrajo y se trató con RNasa R (Epicenter Technologies, EE. UU.). La estabilidad del circRNA y del mRNA lineal se analizó mediante qRT-PCR [44].

Ensayos de actinomicina D

Se agregaron 2 mg/ml de actinomicina D (Sigma) a las células y las células BCa se recogieron en los puntos de tiempo indicados para su posterior análisis como se describió anteriormente [41, 44].

qRT-PCR

Se extrajo el ARN y se obtuvo el ADNc utilizando el kit de reactivos PrimeScriptTMRT (TaKaRa, Japón) para realizar qRT-PCR en una máquina ABI 7900HT (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Se utilizó 2-ΔΔCT para analizar las expresiones de ARN [44].

Construcción de vectores y transfección celular.

Se diseñaron secuencias de shRNA para dirigir los circRNA objetivo, se clonaron MAT2A, TRIM25 o SLC7A6 y se insertaron en el vector pGPU6/GFP/puromicina. La secuencia de circRNA se clonó y se insertó en un vector plenti-ciR-GFP-T2A de IGEbio (Guangzhou, China) para construir el plásmido de sobreexpresión de circRNA. Para sobreexpresar MAT2A o SLC7A6, el vector pENTER con gen idéntico o control se obtuvo de Vigene (Shanghai, China). Flag-TRIM25, Flag-Trim25ΔRBD, Myc-MAT2A, HA-Ub y el plásmido mutante K6, K11, K27, K48 y K63 se adquirieron de Vigene (Shanghai, China). Los ARNip se adquirieron en GenePharma (Shanghai, China). La transfección celular se describió como nuestro trabajo anterior [43].

Ensayo de formación de esferas.

Las células BCa se digirieron y se suspendieron como células individuales en placas de fijación ultrabaja de 6 pocillos, suplementadas con 5 ng/ml de EGF recombinante (Sangon, China). La formación de la esfera se observó 12 días después.

Ensayo de proliferación celular

En el ensayo CCK-8, las células se digirieron y se sembraron a razón de 1,500 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. Detectamos el valor de OD450 en varios momentos después de sembrar en los pozos. Para la prueba de CI50, las células se incubaron con cisplatino y la tasa de viabilidad relativa se calculó en Graphpad Prism 8 para calcular el valor de CI50. Para el ensayo de formación de colonias, las células se digirieron y se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron durante 14 días. Se tomaron imágenes de las colonias después de teñirlas con cristal violeta al 0.2%.

Ensayo de apoptosis y EdU.

El ensayo de apoptosis se realizó con el kit de apoptosis (MultiSciences, China) como en nuestro trabajo anterior [41]. El ensayo EdU se realizó con el kit EdU (RiboBio, China) para detectar la síntesis de ADN [44].

Ensayos de transwell

Las células se tiñeron con cristal violeta al 0.2% en una cámara Transwell (CoStar, EE. UU.). Se analizaron cinco secciones de células seleccionadas al azar para generar análisis estadístico.

acoplamiento molecular

Utilizamos Autodock Vina 1.2.2 para analizar las afinidades de unión entre proteínas. Las coordenadas 3D de las proteínas se descargaron del PDB (http://rcsb.org/PDB). El acoplamiento molecular se visualizó y realizó con AutodockVina 1.2.2 (http://autodock.scripps. educación).

Coinmunoprecipitación

Para el experimento co-IP, las células relativas se lisaron con un suplemento enfriado con una combinación de inhibidores de proteinasa y fosfatasa, con o sin inhibidor de RNasa. El sobrenadante se incubó con anticuerpo conjuntivo o perlas preincubadas con anticuerpo. Las perlas se lavaron y centrifugaron con tampón co-IP para realizar más análisis de transferencia Western.53].

Ensayo desplegable de ARN y ensayo RIP

Se trataron perlas de estreptavidina (Life Technologies, EE. UU.) con sondas circARHGAP10 marcadas con biotina con sondas oligo para realizar un ensayo de extracción de ARN. Se utilizó el kit RIP magnético (Millipore) para realizar el ensayo RIP de acuerdo con las instrucciones del fabricante descritas en nuestro trabajo anterior [43].

Análisis de Western Blot

Las proteínas se lisaron de las células con tampón RIPA y se separaron con SDS-PAGE. Las transferencias se bloquearon y se incubaron con anticuerpos durante la noche. Anticuerpo: GLDC (Abcam, ab232989), SHMT2 (Abcam, ab180786), MAT2A (Proteintech, 55309-1-AP), MTHFR (Abcam, ab203786), SAHH (Abcam, ab151734), CD44 (Abcam, ab243894), Nanog ( Abcam, ab109250), H3 (Abcam, ab1791), H3K4me3 (Abcam, ab213224), H3K9me3 (Abcam, ab8898), H3K27me3 (abcam, ab6002), H3K36me2 (Abcam, ab176921) y H3K36me3 (Abcam, ab9050), H3K79me2 ( Abcam, ab3594) y H3K79me3 (Abcam, ab2621), etiqueta Flag/DDDDK (Abcam, ab205606), etiqueta Myc (Abcam, ab32), etiqueta HA (Abcam, ab9110), TRIM25 (Abcam, ab167154), USP5 (Abcam, ab154170), USP14 (Abcam, ab192618), p-STAT5 (Abcam, ab32364), STAT5 (Abcam, ab230670), SLC7A6 (Abcam, ab235054), GAPDH (Proteintech, 60004-1-lg) se utilizó como control de carga. Las señales se visualizaron utilizando un sistema de imágenes ECL (CLiNX, Shanghai) como se describió anteriormente [44].

Compuestos y reactivos

Los compuestos o enzimas utilizados en este trabajo son los siguientes: cisplatino (Selleck, EE. UU.), FIDAS (Selleck, EE. UU.), MeAIB (Selleck, EE. UU.), BCH (Selleck, EE. UU.), RNasa A (Yeason, China), SAM ( Sigma, EE.UU.), SAH (Sigma, EE.UU.) y HCY (Sigma, EE.UU.). El medio sin ciertos aminoácidos se adquirió de US Biological, EE. UU. Los aminoácidos se compraron en Sangon, China.

Preparación y activación de células T CD8+ in vitro.

Se obtuvieron muestras de tumores frescos poco después del sacrificio de los animales. Los tumores se trituraron y digirieron con una combinación de colagenasa I (Sangon, China) y DNasa I (Sangon, China). Las PBMC se derivaron de pacientes con Ficoll (GE Healthcare, EE. UU.). Las células se estimularon, se tiñeron con marcadores de membrana y se aplicaron a una columna MACS para su posterior análisis.

Citometría de flujo

Se recogieron células T CD8+ extraídas de sangre periférica o tejido canceroso. Las suspensiones unicelulares de células T CD8+ se tiñeron con marcadores de superficie con CD45 (BD Biosciences, 557833), CD3 (BD ​​Biosciences, 552852), CD8 (BD Biosciences, 564526) y PD-1 (BD Biosciences, 561272) [44]. Se utilizó el kit de solución de fijación/permeabilización BD Cytofifix/Cytoperm (BD Biosciences) para teñir marcadores intracelulares, incluidos IFN-g (BD Biosciences, 557643), GZMB (BD Biosciences, 560212) e IL-2 (BD Biosciences, 554566). Las células T CD8 + se analizaron en el citómetro de flujo BD FACS Verse como describimos anteriormente [44].

Estudio animal

Para el modelo de xenoinjerto de células T24-CR subcutáneas, se mantuvieron ratones BALB/c atímicos macho desnudos de 4 semanas de edad (SLARC, Shanghai, China) en un entorno de cultivo libre de patógenos específicos. Las dietas de control y de restricción de metionina se compraron en Xietong (Jiangsu, China), cuya dieta de control contenía un 0.86 % de nutrición de metionina y la dieta MR contenía un 0.12 % de nutrición de metionina en nuestro estudio.30]. Los ratones fueron seleccionados aleatoriamente en cuatro grupos. Un total de 1×10⁷ Se inyectaron células T24-CR-luc-LV-NC o T24-CR-luc-LV-circ por vía subcutánea en ratones desnudos alimentados con dietas de control o MR. Se inyectó cisplatino (6 mg/kg) por vía intraperitoneal una semana después de la implantación celular (una inyección cada 5 días). El volumen del tumor se controló cada 3 días con el cálculo de volumen del tumor = ancho² × longitud/2. Todos los ratones fueron sacrificados después de 6 semanas de tratamiento farmacológico. Los análisis de dilución limitante extrema se realizaron con 5 × 10⁶, 5 × 10⁵ y 5 × 10⁴ Se inyectan células T24-CR por vía subcutánea en ratones desnudos para calcular la tasa exitosa de implantación del tumor.

Para los modelos de xenoinjerto derivado de pacientes (PDX), se trasplantaron por vía subcutánea dos fragmentos frescos de tejido de pacientes con BCa a ratones NOD/SCID de 4 semanas de edad (SLARC, Shanghai, China). cuando el 1^st La generación de los xenoinjertos alcanzó aproximadamente 100 mm.³, el bloque de tejido PDX se aisló y se disolvió mecánicamente en 1 mm³ bloques de tejido para la implantación subcutánea en ratones NOD/SCID para la segunda generación PDX. La segunda generación de PDX se dividió aleatoriamente en cuatro grupos. Los xenoinjertos PDX se inyectaron con 2 nmol de si-NC conjugado con colesterol de grado in vivo o si-circARHGAP2 (RiboBio, Guangzhou, China) alimentados con dietas de control o MR. Se inyectó cisplatino (5 mg/kg) por vía intraperitoneal una semana después de la implantación celular (una inyección cada 5 días). El volumen del tumor se controló cada 6 días con el cálculo del volumen del tumor = (ancho² × longitud/2). Todos los ratones fueron sacrificados después de 6 semanas de la segunda implantación de PDX.

Para el modelo de metástasis pulmonar de células T24-CR, 1 × 10⁵ Se inyectaron por vía intravenosa células T24-CR-luc-LV-NC o T24-CR-luc-LV-circ en las colas de ratones BALB/c atímicos macho desnudos de 4 semanas de edad (SLARC, Shanghai, China) alimentados con control o Dietas MR. Se inyectó cisplatino (6 mg/kg) por vía intraperitoneal una semana después de la inyección de células (una inyección cada 5 días). Después de 30 días, se controló la metástasis del desarrollo del tumor mediante IVIS tras una inyección intraperitoneal de 200 mg/kg de luciferina.

Para el xenoinjerto de células MB49-CR subcutáneo, ratones C4BL/57 machos de 6 semanas de edad (SLARC, Shanghai, China). Un total de 1×10⁷ Se inyectaron células MB49-CR-LV-NC o MB49-CR-LV-circ por vía subcutánea en ratones alimentados con dietas de control o MR. Se inyectaron por vía intraperitoneal anti-PD-L1 e IgG1 (Bioxcell) (100 μg/ratón) una semana después de la implantación celular (una inyección cada 3 días). Se inyectó BCH (180 mg/kg) por vía intravenosa una semana después de la implantación celular (una inyección cada 3 días). Se inyectó cisplatino (6 mg/kg) por vía intraperitoneal una semana después de la implantación celular (una inyección cada 5 días). El volumen del tumor se controló cada 3 días con el cálculo del volumen del tumor = (ancho² × longitud/2). Todos los ratones fueron sacrificados después de 6 semanas de tratamiento farmacológico. Todos los experimentos con animales incluidos en este estudio fueron aprobados con el número de aprobación 202212002 S.

IHC

Se incluyeron muestras de tejido tumoral y tejido de hígado de ratón en parafina mientras se realizaba tinción con IHC y H&E.44, 54]. Los anticuerpos primarios fueron Ki-67 (Abcam, ab270650), MAT2A (Proteintech, 55309-1-AP), SLC7A6 (Abcam, ab235054), CD44 (Abcam, ab243894) y CD8A (Abcam, ab217344).

análisis estadístico

El análisis estadístico se analizó con el método de Student. t-test o la prueba de Chi-cuadrado en Graphpad Prism 8 [55]. Se aplicó la curva KM para el análisis de supervivencia general [56, 57]. determinamos que p < 0.05 fue estadísticamente significativo.

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41419-023-06050-1