Materiales

El diclorhidrato del agonista 7 de TLR8/1 se adquirió de Cayman Chemical. El 1,2-epoxidodecano (C12) se obtuvo de Sigma-Aldrich. Core 200 se personalizó de Enamine y se compraron otros núcleos de poliamina de Sigma-Aldrich y TCI. El anticuerpo anti-CD16/32 de ratón, el anticuerpo APC anti-CD11c de ratón, el anticuerpo FITC anti-CD80 de ratón, el anticuerpo PE anti-CD86 de ratón, el anticuerpo APC anti-CD11c humano, el anticuerpo FITC anti-CD80 humano y el anticuerpo PE anti-CD86 humano fueron Comprado en Biolegend. ELISA sin recubrimiento de IL-1β de ratón, ELISA sin recubrimiento de IL-12p70 de ratón, ELISA sin recubrimiento de TNF-α de ratón, ELISA sin recubrimiento de MCP-1 de ratón, ELISA sin recubrimiento de IL-1β humana, ELISA sin recubrimiento de IL-12p70 humana, ELISA sin recubrimiento de TNF-α humano, LysoTracker Deep Red, LysoTracker Green, DiO y DiR se compraron a Invitrogen. El ELISA de haptoglobina de ratón y el ELISA de IP-10 de ratón se obtuvieron de Abcam. 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina, DMG-PEG y colesterol se obtuvieron de Avanti Polar Lipids. DLin-MC3-DMA y SM-102 se adquirieron de MedChem Express. El ARNm de luciferasa modificado con m1ψ optimizado por codón y el ARNm de pico modificado con diprolina (S2P) del SARS-CoV-2 se produjeron mediante transcripción in vitro¹⁴. El ARNm de luciferasa marcado con Cy5 se produjo internamente mediante la incorporación de Cy5-UTP (TriLink) en la reacción de transcripción in vitro.

Síntesis de lipidoide adyuvante

El lipidoide adyuvante C12-TLRa se sintetizó haciendo reaccionar epoxidodecano (C12) con diclorhidrato del agonista 7 de TLR8/1 usando la reacción de apertura del anillo²⁵. Brevemente, se disolvieron 10 mg de diclorhidrato del agonista 7 de TLR8/1 en 0.8 ml de etanol en un vial de vidrio con una barra de agitación magnética. Luego, se agregaron 8 μl de trietilamina para neutralizar el clorhidrato antes de agregar 20 mg de C12. El vial se selló y la mezcla se agitó durante 48 ha 80 °C. El producto bruto se purificó mediante un sistema de cromatografía CombiFlash NextGen 300+ (Teledyne ISCO) con elución en gradiente de CH₂Cl₂ a 75:22:3 canales₂Cl₂/MeOH/NHXNUMX₄OH (ac.). Se recogió la fracción deseada (rendimiento, 44%). C12-TLRa se caracterizó por espectrometría de masas (MS calculado, 728.12; encontrado [M + 2H]²⁺, 365.25) y espectroscopía de RMN. ¹RMN H (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 7.78 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.57 (doblete de dobletes, J = 8.4, 1.3 Hz, 1H), 7.35–7.29 (m, 1H), 7.27 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.05–7.00 (m, 1H), 6.98 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.84 (s, 2H), 3.61–3.47 (m, 2H), 3.44 (s, 2H), 2.90 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.68 (q, J = 1.9 Hz, 2H), 2.34 (t, J = 2.8 Hz, 2H), 1.69 (quinteto, J = 7.6 Hz, 2H), 1.37 (doblete de tripletes, J = 14.9, 7.5 Hz, 2H), 1.22 (s, 36H), 0.90–0.81 (m, 9H).

Método general para la síntesis de lipidoides derivados de poliaminas

Los núcleos de poliamina se hicieron reaccionar con un exceso de moles de C12 según fuera necesario para saturar las aminas.^25,33. Tomando C12-113 como ejemplo, se mezcló núcleo 113 (1 equiv.) con C12 (4.8 equiv.) durante 48 h a 80 °C en estado puro. El producto crudo se usó para la exploración inicial de la biblioteca. Para purificar el lipidoide C12-113 de alto rendimiento, el producto bruto se separó como se describe anteriormente y el producto totalmente saturado se recogió e identificó mediante espectrometría de masas (MS calculado, 854.49; encontrado [M + 2H]²⁺, 429.13) y utilizado para experimentos posteriores.

Simulación estructural de la interacción agonista-TLR7

Las estructuras del agonista 7 de TLR8/1 y C12-TLRa se optimizaron primero mediante simulación de dinámica molecular con el campo de fuerza CHARMm⁴⁵. La estructura cristalina exacta de la proteína TLR7 se derivó de la estructura del complejo TLR7/R848 (PDB ID, 5GMH), eliminando cualquier ligando o molécula de disolvente²⁶. La simulación estructural entre el dímero TLR7 y los agonistas se llevó a cabo mediante la simulación de acoplamiento de CDocker⁴⁶ y superposición estructural in situ. Las posibles interacciones no covalentes, los bolsillos de unión y las descripciones generales de los sitios de unión entre el dímero TLR7 y los agonistas correspondientes se generaron utilizando BIOVIA Discovery Studio 2018.

formulación LNP

Los LNP se formularon mediante mezcla microfluídica³⁰. Brevemente, una fase de etanol que contiene lipidoide (con o sin sustitución C12-TLRa), fosfolípido, colesterol y DMG-PEG en una proporción molar designada (Tabla complementaria 1) se mezcló con una fase acuosa (tampón de citrato 10 mM, pH 3) que contenía ARNm en una proporción de caudal de 1:3 y en una proporción en peso de lípidos/ARN de 10:1 en un dispositivo de chip microfluídico. Los LNP se dializaron frente a PBS 1x en un casete de corte de peso molecular de 20 kDa durante 2 h, se esterilizaron a través de un filtro de 0.22 μm y se almacenaron a 4 °C. Los LNP marcados con DiO o DIR se obtuvieron mezclando DiO o DiR (1% en moles de lípidos totales) con LNP antes de la diálisis.

caracterización LNP

El tamaño hidrodinámico, el PDI y el potencial zeta de los LNP se midieron utilizando un Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments). La morfología de los LNP se caracterizó por TEM (JEOL 1010) y crio-EM (Titan Krios, Thermo Fisher) con un K3 Bioquantum (Gatan). La eficiencia de encapsulación de ARNm y la pK_a de LNP se determinaron utilizando un ensayo de ARN Quant-iT RiboGreen modificado (Invitrogen) y un 6-(pensayo de ácido -toluidinil)naftaleno-2-sulfónico, respectivamente^30,33. Las formulaciones de LNP se examinaron de forma rutinaria mediante la prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL), y se encontró consistentemente que los niveles de endotoxina eran <1 unidad de endotoxina por ml.

Cultivos celulares y estudios en animales.

La línea celular HEK-Blue mTLR7 fue proporcionada amablemente por J. Shi en la Escuela de Medicina de Harvard, quien la obtuvo de InvivoGen (#hkb-mtlr7). Estas celdas se mantuvieron de acuerdo con las instrucciones del proveedor. La línea celular de macrófagos murinos DC2.4 se obtuvo de la American Type Culture Collection y se mantuvo en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10%, 100 U ml^-1 penicilina y 100 μg ml^-1 estreptomicina. Todas las células se cultivaron a 37 °C en una incubadora humidificada con 5 % de CO₂y probados rutinariamente para detectar contaminación por micoplasma.

Los BMDC se generaron a partir de ratones C57BL/6. Brevemente, se lavaron células de la médula ósea de fémures y tibias de ratón, se lisaron con tampón de cloruro de amonio y potasio (ACK) para eliminar los glóbulos rojos y luego se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10 %, 100 U ml^-1 penicilina y 100 μg ml^-1 estreptomicina, HEPES al 1 %, β-mercaptoetanol 0.1 mM, 20 ng ml^-1 IL-4 murina (#214-14, PeproTech) y 20 ng ml^-1 factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos murinos (#315-03, PeproTech). El día 6, se recogieron células no adherentes y poco adherentes para estudios.

Los MoDC se generaron a partir de un donante voluntario masculino sano de 38 años. Los monocitos se aislaron de la sangre de aféresis donada utilizando el Cóctel de enriquecimiento de monocitos humanos RosetteSep (n.º 15068, Stemcell Technologies) y proporcionados por el Núcleo de inmunología humana de la Universidad de Pensilvania. Estas células se indujeron en MoDC cultivándolas en medio RPMI completo suplementado con 20 ng ml^-1 IL-4 humana (#574002, Biolegend) y 20 ng ml^-1 factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos humanos (#572902, Biolegend) durante 6 días. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pennsylvania (#705906). Se obtuvo el consentimiento informado del donante, quien fue compensado por esta donación de sangre.

Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania (# 806540), y los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las Pautas para el cuidado y uso de animales de laboratorio de la Universidad de Pensilvania. Se compraron ratones hembra C57BL/6 (6–8 semanas de edad, 18–20 g de peso corporal) de Jackson Laboratory.

Entrega de mLuc in vitro

Se sembraron células DC, BMDC o MoDC en una placa de 96 pocillos a una densidad de 10,000 24 por pocillo durante la noche y luego se usaron LNP cargados con mLuc para tratar las células a las dosis indicadas durante 1000 h. La expresión de luciferasa se evaluó mediante el sistema de ensayo Luciferase Reporter 4550 (E7572, Promega) y la viabilidad celular se midió mediante un ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (GXNUMX, Promega) de acuerdo con los protocolos del fabricante. La expresión relativa de luciferasa se informó como unidades de luz relativas normalizadas a la viabilidad celular. Se usó ARNm libre como control.

Ensayo de reportero TLR7

La actividad agonista de TLR7 de C12-TLRa se analizó en células indicadoras HEK-Blue mTLR7 utilizando un kit de detección HEK-Blue (#hb-det2, InvivoGen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células indicadoras HEK-Blue mTLR7 se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 40,000 12 células por pocillo en medio de detección HEK-Blue que contenía diferentes concentraciones de C24-TLRa. Después de la incubación durante 650 h, se midió la absorbancia a 200 nm utilizando un lector de placas (Infinite M7, Tecan) y los datos se normalizaron para las células no tratadas. El agonista 8 de TLR1/7 se utilizó como control positivo. De manera similar, se midió la actividad agonista de TLRXNUMX de los LNP.

Captación celular

Las células DC2.4 se sembraron en placas con fondo de vidrio de 35 mm durante 24 h y luego se trataron con C12-113 LNP marcado con DiO o C12-113/TLRa LNP marcado con DiO a una concentración de ARNm de 500 ng ml^-1 durante 2 h. Las células se tiñeron secuencialmente con LysoTracker Deep Red (100 nM) durante 30 min y Hoechst 33342 (10 μg ml^-1) durante 5 min. Las imágenes se tomaron inmediatamente utilizando un microscopio de barrido láser confocal (LSM 710, Zeiss).

Análisis de maduración de DC y producción de citocinas in vitro

Se sembraron células DC2.4 o BMDC en una placa de 12 pocillos a una densidad de 1 × 10⁶ células por pozo durante la noche y luego se trataron con LNP cargados con ARNm de SARS-CoV-2 (500 ng ml^-1) durante 24 horas. Se recogieron cultivos celulares para ELISA de TNF-α, IL-12p70 e IL-1β. Se recogieron las células, se bloquearon con anticuerpo anti-CD16/32 de ratón y luego se tiñeron con anticuerpo APC anti-CD11c de ratón, anticuerpo FITC anti-CD80 de ratón y anticuerpo PE anti-CD86 de ratón durante 30 min a 4 °C antes de analizarlas por citometría de flujo. (BD, LSR II). De manera similar, se trataron los MoDC. Se recogieron cultivos celulares para ELISA de TNF-α, IL-12p70 e IL-1β humanos. Las MoDC se recogieron y se tiñeron con anticuerpo APC anti-CD11c humano, anticuerpo FITC anti-CD80 humano y anticuerpo PE anti-CD86 humano antes del análisis. Los anticuerpos se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante con una dilución típica de 1:100.

Análisis de maduración de DC y producción de citocinas in vivo

Se recolectaron dos iLN de cada ratón a las 24 h después de la inyección de LNP cargados con ARNm de SARS-CoV-2 (5 μg de ARNm por ratón) en la base de la cola y se rompieron mecánicamente con cuidado utilizando morteros estériles en 0.1 ml de medio completo RPMI en un tubo de 1.5 ml. Las suspensiones de células resultantes se recogieron, se bloquearon con anticuerpo anti-CD16/32 de ratón y luego se tiñeron con anticuerpo APC anti-CD11c de ratón, anticuerpo FITC anti-CD80 de ratón y anticuerpo PE anti-CD86 de ratón antes de ser analizados por citometría de flujo.

La sangre se recogió en tubos separadores de suero (BD n.º 365967) a través de la ruta retroorbital a las 6 y 24 h después de la inmunización. El suero se separó de la sangre después de un período de incubación de 30 min a temperatura ambiente (ta), y las muestras se centrifugaron a 10,000 XNUMXg durante 5 min. El suero se almacenó a -20 °C hasta su uso. Para analizar la producción de citocinas intralinfáticas, las suspensiones celulares resultantes de iLN se colocaron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 10,000 células por 100 μl por pocillo y se cultivaron durante 8 h. Se recogió el sobrenadante para ELISA de TNF-α, IL-12p70 e IL-1β junto con muestras de suero. Además, se recogió suero a las 6, 24 y 48 h post-inmunización para ELISA de haptoglobina, IP-10 y MCP-1.

Distribución y transfección de LNPs in vivo

A los ratones se les inyectaron sc en la base de la cola LNP cargados con mLuc a una dosis de 5 µg de ARNm por ratón. A las 6 o 24 h después de la inyección, los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal (ip) con d-sal potásica de luciferina (150 mg por kg (peso corporal)), y se realizaron imágenes de bioluminiscencia en un sistema de imágenes IVIS (PerkinElmer). Para permitir la formación de imágenes de bioluminiscencia y fluorescencia simultáneas, se inyectaron sc en ratones LNP marcados con DiR y cargados con mLuc. A las 24 h después de la inyección, los ratones fueron inyectados ip con d-sal de potasio de luciferina, y los principales órganos e iLN se recolectaron para obtener imágenes de bioluminiscencia y fluorescencia.

Inmunización in vivo

Los ratones se inmunizaron sc con LNP cargados con ARNm de SARS-CoV-2 a una dosis de 1 o 5 μg de ARNm por ratón dos veces usando una estrategia de refuerzo en un intervalo de 3 semanas. El peso corporal se registró dos veces por semana durante el experimento. El suero se recolectó usando tubos separadores de suero como se describe anteriormente, se almacenó a -20 °C y se usó para ELISA y ensayo de neutralización de virus. Dos semanas después de la vacunación de refuerzo, se anestesiaron los ratones y se recogieron los bazos para el análisis de citometría de flujo.

Determinación de títulos de anticuerpos anti-RBD mediante ELISA

RBD marcado con SARS-CoV-2 His purificado (1 μg ml^-1) (Sino Biological, n.º 40592-V08H) para recubrir microplacas de poliestireno transparente de 96 pocillos High Bind Stripwell Corning durante la noche. Las placas se lavaron una vez con tampón de lavado (Tween 0.05 al 20 %/PBS) y se bloquearon durante 2 h a temperatura ambiente usando una solución de albúmina de suero bovino sin proteasa, empobrecida en IgG y inactivada por calor (BSA al 2 % p/v/PBS). ). Posteriormente, las placas se lavaron tres veces y los sueros de ratón se diluyeron en serie en la solución de bloqueo y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. , Abcam #ab1) o subclases (IgG10,000, 97040:1 1, Abcam, #ab10,000; IgG98693c, 2 10,000, Abcam, #ab98722) en el búfer de bloqueo. Las placas se incubaron durante 1.5 hy se lavaron tres veces antes de añadir 100 µl de sustrato KPL 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina por pocillo durante 8 min. La reacción se detuvo añadiendo 50 µl de ácido sulfúrico 2 N y la absorbancia se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas SpectraMax 190. El título de dilución de punto final de IgG específica de RBD se definió como la dilución más alta de suero para dar una densidad óptica mayor que el valor de densidad óptica de corte determinado mediante el método de Frey.⁴⁷.

Ensayo de neutralización de pseudovirus

Se produjo por primera vez un pseudotipo VSV con SARS-CoV-2 S³⁶. Realizamos un ensayo de neutralización de anticuerpos utilizando VSVΔG-RFP SARS-CoV-2. Se sembraron células Vero E6 que expresaban TMPRSS2 de forma estable en 100 μl de DMEM a 2.5 × 10⁴ células por pocillo en una placa recubierta de colágeno de 96 pocillos. Después de 12 h, las muestras de suero diluidas dos veces en serie se mezclaron con el virus del pseudotipo VSVΔG-RFP SARS-CoV-2 (50–200 unidades formadoras de focos por pocillo) que codifican el pico de la variante D614G, Beta o Delta y se incubaron durante 1 h a 37ºC. ºC También se incluyó en esta mezcla un anti-VSV Indiana G de ratón, 8G5F11 (#Ab01401-2.0, Absolute Antibody), para neutralizar cualquier potencial virus VSV-G en una concentración de 100 ng ml^-1. La mezcla de anticuerpo y virus se usó luego para reemplazar los medios en las células Vero E6 TMPRSS2. A las 20 h después de la infección, las células se lavaron y fijaron con PFA al 4 % antes de visualizarlas en un S6 FluoroSpot Analyzer (CTL). Se enumeraron los focos infectados individuales y se compararon los valores con pocillos de control sin anticuerpo. El título de neutralización de reducción de foco 50% (FRNT₅₀) se midió como la mayor dilución de suero en la que el recuento de focos se redujo en al menos un 50 % con respecto a las células de control que se infectaron con el pseudotipo de virus en ausencia de suero de ratón. DELANTERO₅₀ los títulos de cada muestra se midieron en dos réplicas técnicas realizadas en días separados.

Análisis de citometría de flujo de células T y B

célula T

Los bazos se recogieron, se procesaron como células individuales, se filtraron utilizando un filtro de células de 70 µm en RPMI 1640 completo y se centrifugaron, y los glóbulos rojos se lisaron en tampón de lisis ACK para obtener una suspensión de células individuales transparente. Para medir las células T específicas de antígeno, se estimularon dos millones de esplenocitos con 2.5 µg ml^-1 de grupos de péptidos SARS-CoV-2 RBD (#PM-WCPV-S-RBD-1, JPT) en un tubo FACS durante 6 h a 37 °C, 5 % de CO₂ con 2 mg ml^-1 anti-CD28 (Tonbo #40-0281-M001) proporcionando coestimulación. Las estimulaciones continuaron durante 1 h antes de agregar 5 mg ml^-1 brefeldin A (Biolegend #420601), monensina 2 mM (Biolegend #420701) y 5 mg ml^-1 anti-CD107a Alexa Fluor 647 (Biolegend #121610) durante 5 h. DMSO sirvió como control negativo, y la combinación de 50 mg ml^-1 forbol 12-miristato 13-acetato y 1 mg ml^-1 la ionomicina sirvió como control positivo. Después de un total de 6 h, las muestras se lavaron con PBS, se tiñeron con Live/Dead Aqua durante 5 min, se bloquearon con anticuerpo anti-CD16/32 de ratón durante 20 min y se tiñeron extracelularmente durante 30 min con anticuerpos (Figs. 21d y 27d). Las células se lavaron en tampón FACS, se fijaron y permeabilizaron con el kit Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences n.º 554714) y se tiñeron intracelularmente con anticuerpos durante 30 min (Figs. 21d y 27d). Después de la tinción intracelular, las células se lavaron dos veces y se fijaron con 300 µl (1 % de PFA), y las muestras se adquirieron en un BD LSR II equipado con cuatro líneas láser y 18 tubos fotomultiplicadores. La estrategia de selección, la lista de anticuerpos y los números de catálogo se proporcionan en las Figs complementarias. 21 y 27.

Célula B de memoria

Los bazos se recogieron, se procesaron como células individuales, se filtraron con un filtro de células de 40 µm en RPMI 1640 completo y se centrifugaron a 300g durante 5 minutos; los glóbulos rojos se lisaron con ACK (1 min), se lavaron dos veces y se contaron, y se incubaron dos millones de células por muestra con anticuerpo anti-CD16/32 de ratón durante 20 min a 4 °C. Luego, las células se lavaron con tampón FACS (1% BSA/PBS) y se tiñeron durante 1 h usando anticuerpos (Fig. 23d). Después de la tinción, las células se lavaron dos veces y se fijaron con 300 µl (1 % de PFA), y las muestras se adquirieron en un BD LSR II equipado con cuatro líneas láser y 18 tubos fotomultiplicadores. La estrategia de activación y la lista de anticuerpos, sondas RBD fluorescentes¹⁴ y los números de catálogo se proporcionan en la figura complementaria. 23.

ensayo ELISpot

Se lavó la médula ósea de los fémures y la tibia en tampón FACS y se filtró a través de una malla Nitex de 63 µm. Los glóbulos rojos se lisaron en tampón ACK durante 5 min en hielo y se lavaron dos veces con tampón FACS. Las células resultantes se contaron usando un Beckman Coulter ViCell. Las placas de filtro MultiScreenHTS IP, 0.45 µm (Millipore Sigma, MSIPS4W10), se recubrieron con antígeno de proteína RBD a 10 µg ml^-1 en tampón de carbonato de sodio/bicarbonato de sodio pH 9.6 (NaHCO 35 mM₃ y Na 15 mM₂CO₃) durante 1 hora a 37 °C. A continuación, las placas se lavaron tres veces con 200 µl de PBS por pocillo y se bloquearon a 37 °C en RPMI completo durante 30 min. Las células de médula ósea se sembraron en placas en seis diluciones a la mitad comenzando con un millón de células de médula ósea totales por pocillo y se incubaron durante la noche en RPMI completo. A continuación, las placas se lavaron con tampón de lavado (1x PBS + Tween 0.1 al 20 %) cinco veces y se añadió un anticuerpo de detección anti-IgG biotinilado (anuncios humanos IgG anti-ratón de cabra-BIOT; Southern Biotech, 1030-08) al final. dilución de 3 μg ml^-1 en BSA al 2 %/PBS y se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Las placas se lavaron de nuevo cinco veces y se añadió estreptavidina-fosfatasa alcalina (dilución 1:20,000 en BSA/PBS al 2 %) antes de la incubación a temperatura ambiente durante 30 min. A continuación, las placas se lavaron cinco veces con tampón de lavado y se añadieron 50 µl por pocillo de solución de cloruro de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato/nitroazul de tetrazolio (Sigma, n.° B1911, 100 ml) durante ~10 min o hasta que se desarrollaron manchas, en cuyo momento la reacción se inactivó con 100 µl de solución monobásica de fosfato sódico 1 M. Después de lavar las placas con H desionizado₂O y secados durante la noche, se escanearon y contaron usando un S6 FluoroSpot Analyzer.

Estadística y reproducibilidad

Todos los datos se presentan como media ± sd Student's tSe aplicó la prueba o el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba de Tukey para la comparación entre dos grupos o entre múltiples grupos usando Graphpad Prism 7.0, respectivamente. P < 0.05 se consideró estadísticamente significativo. Cada experimento se repite al menos tres veces de forma independiente con resultados similares y se presenta el conjunto de datos representativo.

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de la cartera de naturaleza vinculado a este artículo.

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01404-4