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Robustez: vinculando el diseño de cepas a bioprocesos viables

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Se necesitan nuevos diseños de fábricas de células para bioprocesos robustos a escala industrial

Durante el siglo pasado, los microorganismos han sido explotados en la bioproducción industrial.

  • Demain AL
Biotecnología microbiana.

] de metabolitos primarios (p. ej., etanol y ácido láctico) y secundarios (p. ej., terpenoides), células (p. ej., cultivos iniciadores y probióticos) y proteínas (p. ej., enzimas) [

  • Rahmat E.
  • kang y
Ingeniería metabólica de levadura para la producción de metabolitos secundarios farmacéuticamente importantes.

,

  • Fenster K.
  • et al.
La producción y entrega de probióticos: una revisión de un enfoque práctico.

,

  • Bagamery LE
  • et al.
Una supuesta estrategia de cobertura de apuestas amortigua la levadura en ciernes contra la inestabilidad ambiental.

]. Han surgido dos estrategias diferentes para satisfacer la creciente demanda de productos de base biológica. En el primero, los productos petroquímicos económicos se reemplazan por alternativas sostenibles producidas por microbios; sin embargo, las materias primas abundantes y complejas, como la lignocelulosa y las corrientes de gas laterales, siguen siendo un desafío para la fermentación microbiana [

  • zhang y.
  • et al.
La importancia de la ingeniería de la funcionalidad fisiológica en los microbios.

]. En el segundo, se está desarrollando una gama de nuevos bioproductos que incluyen probióticos agrícolas, proteínas nutricionales, materiales de seda y bacterias que degradan el plástico, pero su explotación más amplia sigue estando limitada por la ineficiencia del proceso y los problemas de ampliación.

  • wehrs m.
  • et al.
Ingeniería de microbios de producción robustos para el cultivo a gran escala.

]. Central para ambas estrategias es microbiana robustez (consulta: Glosario), que describe la estabilidad de un fenotipo (p. ej., título, tasa de producción y rendimiento) cuando son desafiados por diferentes perturbaciones o interrupciones [

  • Stelling J.
  • et al.
Robustez de las funciones celulares.

,

  • Félix MA
  • Barkoulas M.
Robustez generalizada en los sistemas biológicos.

,

Hacia una teoría de la robustez biológica.

,

  • gong z
  • et al.
Robustez de ingeniería de fábricas de células microbianas.

]. Aunque la ingeniería de deformaciones ha mejorado enormemente desde mediados de la década de 1990 [

  • Bailey JE
Ingeniería metabólica.

], la pobre robustez limita la producción microbiana a escala industrial. Las bioindustrias se esfuerzan constantemente por obtener mejores cepas, pero su desarrollo en el laboratorio a menudo no tiene en cuenta las múltiples perturbaciones que se encuentran en los entornos industriales. Esta falta de supervisión estratégica da como resultado cepas de bajo rendimiento en condiciones a gran escala, lo que lleva a un aumento de los costos de comercialización de nuevos bioprocesos.

  • Dheskali E.
  • et al.
Modelado de evaluación de riesgos de la economía de productos químicos de base biológica basado en simulaciones de Monte-Carlo.

].

La presente revisión define y discute la robustez microbiana desde diferentes perspectivas, enfatizando la contribución de muchos campos de la biología a las aplicaciones industriales de la robustez microbiana. Discutimos la importancia de las subpoblaciones en el rendimiento de la tensión y las herramientas para comprender las variaciones de rendimiento de una sola célula. También discutimos las diversas perturbaciones industrialmente relevantes que demuestran cómo la robustez es un concepto distinto y más amplio que tolerancia. Finalmente, proponemos principios para cuantificar rutinariamente la robustez como una guía para diseñar fábricas de células a través de modelos matemáticos.

Cuantificación de robustez para predicciones precisas de rendimiento microbiano

La robustez es un término abstracto y relativo que puede ser difícil de cuantificar de manera estandarizada. Su cuantificación ayudaría a los ingenieros de cepas industriales a identificar cepas robustas para procesos más eficientes y rentables, o para dilucidar funciones celulares complejas como la producción de proteínas y la proliferación del cáncer.

  • Bianconi F.
  • et al.
Análisis de robustez condicional para el descubrimiento de fragilidad e identificación de objetivos en redes bioquímicas y en biología de sistemas de cáncer.

]. Un estudio de alto rendimiento sobre E. coli con el metabolismo del carbono central interrumpido mostró que, a pesar de numerosas perturbaciones genéticas y ambientales, las bacterias podían redirigir los flujos con solo cambios menores en el transcriptoma y la expresión de proteínas.

  • Ishii N.
  • et al.
Múltiples análisis de alto rendimiento monitorean la respuesta de E. coli a las perturbaciones.

]. Este ejemplo confirma el estrecho vínculo entre la cuantificación de la robustez y los aspectos bioquímicos, metabólicos y genéticos que determinan las funciones celulares (p. ej., la manifestación y cuantificación de fenotipos relevantes) [< div class="dropBlock reference-citations">

  • Mielenz JR
  • Hogsett DA
Mejora de la robustez microbiana utilizando biología de sistemas.

]. La robustez se ha cuantificado con biomarcadores que miden la ventaja contra el estrés letal conferido por la exposición a estrés leve. El índice de robustez se expresó como el número de microorganismos N sobrevivir al estrés después de un tiempo t en comparación con N en el tiempo cero [

  • den Besten HMW
  • et al.
Biomarcadores a corto y largo plazo para la robustez bacteriana: un marco para cuantificar las correlaciones entre los indicadores celulares y el comportamiento adaptativo.

] (según nuestro Glosario, este último método cuantificaría la tolerancia). Llevando la cuantificación más allá, considerando la robustez R como una propiedad de un sistema s para mantener una función a bajo perturbaciones internas y externas P [

Robustez biológica.

], la robustez se puede explicar mediante la Ecuación 1 presentado por Kitano [

Hacia una teoría de la robustez biológica.

]:

Ra,PS=∫PψpDaspdp

[ 1 ]

La robustez se define aquí como la integración en todo el espacio P de la función de probabilidad ψ(p) (la probabilidad de ocurrencia de una sola perturbación, p) multiplicado por una función de evaluación Da(p). Este último describe hasta qué punto una función específica a se perturba cuando se somete a p en comparación con un estado no perturbado p0 (Figura 5 y XNUMXA ). Si la función (p. ej., rendimientos, tasa de crecimiento específica) de un sistema no se altera a lo largo de varias perturbaciones, el sistema es más robusto que uno cuya función se ve muy afectada en el mismo rango de perturbaciones (Figura 5 y XNUMXB). Ecuación 1 podría describir la robustez de un microorganismo específico (el sistema, por ejemplo, S. cerevisiae CEN.PK113-7D) con respecto al título de producción de etanol (la función) en condiciones de crecimiento industrial (el espacio de perturbación, p. ej., temperatura, oxigenación, inhibidores) ponderado por la probabilidad de encontrar la condición en sí (p. ej., 30 °C, muy probable; 50 °C , raramente probable). Para lograr una estimación más amplia de la robustez, el concepto se puede ampliar considerando múltiples funciones deseadas a, como otros indicadores de desempeño y crecimiento. Cuando se combinan varios parámetros, la solidez de cada función se puede ponderar de manera diferente en función del resultado deseado del proceso: la tasa máxima de crecimiento específico y el rendimiento de biomasa son más importantes que el rendimiento de etanol cuando S. cerevisiae se usa para hornear. Ecuación 1 se ha utilizado en los últimos años para realizar análisis de robustez condicional en modelos de ecuaciones diferenciales ordinarias (ODE) que describen vías o redes de interacción bioquímica del cáncer de pulmón.

  • Bianconi F.
  • et al.
CRA toolbox: paquete de software para análisis de robustez condicional de modelos biológicos de sistemas de cáncer en MATLAB.

]. El análisis identificó nodos en la vía que son cruciales para el cáncer c
la proliferación celular y representan posibles nuevos objetivos farmacológicos.

  • Bianconi F.
  • et al.
CRA toolbox: paquete de software para análisis de robustez condicional de modelos biológicos de sistemas de cáncer en MATLAB.

].

Figure 5

Figura 5 y XNUMXCuantificación de robustez.

(A) Representación de la robustez según la Ecuación . Robustez (R) se describe como la integración a través del espacio P (conjunto de múltiples perturbaciones, pn) de la función de probabilidad ψ(p) multiplicado por una función de evaluación Da(P) (relación entre la función a en la perturbación seleccionada p y la misma funcion a en la condición de control p0). (B) Perturbaciones (p1, p2y p3) y fenotipos (a1, a2y a3) de dos sistemas (s1 y s2) se muestran en la cuadrícula. En el ejemplo, el sistema 1 comprende más estados no perturbados que el sistema 2 y puede considerarse más robusto. La línea gruesa a lo largo del gráfico representa un umbral por encima del cual fallan todos los fenotipos para todos los sistemas.
El análisis de robustez condicional, tal como se utiliza para las redes de cáncer de pulmón, podría aplicarse en biotecnología industrial para la identificación de nodos de red que puedan actuar como marcadores de robustez.

  • Bianconi F.
  • et al.
Análisis de robustez condicional para el descubrimiento de fragilidad e identificación de objetivos en redes bioquímicas y en biología de sistemas de cáncer.

,

  • Bianconi F.
  • et al.
CRA toolbox: paquete de software para análisis de robustez condicional de modelos biológicos de sistemas de cáncer en MATLAB.

]. Mediante la identificación de vías metabólicas vinculadas a la solidez de funciones específicas (p. ej., mediante el uso de modelos metabólicos a escala del genoma), se podría simular cómo cambian los niveles de enzimas cuando los parámetros cinéticos se ven perturbados por perturbaciones ambientales o intracelulares.

  • Bianconi F.
  • et al.
Análisis de robustez condicional para el descubrimiento de fragilidad e identificación de objetivos en redes bioquímicas y en biología de sistemas de cáncer.

,

  • Bianconi F.
  • et al.
CRA toolbox: paquete de software para análisis de robustez condicional de modelos biológicos de sistemas de cáncer en MATLAB.

]. además de la ecuación 1, otra medida de robustez comúnmente utilizada es el coeficiente de variación (CV), que se expresa como la desviación estándar σ de la media μ de una cantidad medida (p. ej., rendimiento del producto, perfil de expresión génica, etc.) dividida por la media μ. Las mediciones han incluido el tamaño de las ráfagas de ARNm transcripcional [

  • wang y.
  • et al.
Mecanismo de señalización del estallido transcripcional: un estudio técnico independiente de la resolución.

] para determinar ruido de expresión, así como evaluaciones de estabilidad temporal en ecología [

  • ma z
  • et al.
El calentamiento climático reduce la estabilidad temporal de la producción de biomasa de la comunidad vegetal.

]. CV se puede sustituir por el factor Fano, en el que la varianza de una cantidad medida se divide por su media. A menudo se prefiere el factor Fano al CV porque permite una cuantificación más fiable y estandarizada [

  • wang y.
  • et al.
Mecanismo de señalización del estallido transcripcional: un estudio técnico independiente de la resolución.

,

  • ma z
  • et al.
El calentamiento climático reduce la estabilidad temporal de la producción de biomasa de la comunidad vegetal.

,

  • Trivellín C.
  • et al.
Cuantificación de la robustez microbiana.

]. En ingeniería metabólica, el CV se ha utilizado para calcular la robustez de los flujos de las vías metabólicas.

  • yang l
  • et al.
Caracterización de la diversificación de la vía metabólica en el contexto del tamaño de la perturbación.

] como se describe en la Ecuación 2:

R=1-σμ

[ 2 ]

Fórmula de Kitano (Ecuación 1), el CV (Ecuación 2), y el factor de Fano determinan la estabilidad de una función dada en un espacio perturbado (es decir, la robustez). Sin embargo, mientras que CV describe la variabilidad de la cantidad medida en varias condiciones con respecto a la media, Kitano mide cómo cambia la cantidad cuando se expone a diferentes perturbaciones en comparación con una condición de control. Por lo tanto, Kitano requiere una condición de control y atribuye a la robustez la capacidad de mantener todas las funciones iguales a la condición de control. Por el contrario, CV se centra en la variabilidad de las funciones, independientemente de si se comportan de manera diferente a una condición de control. Además, Kitano no considera que todas las perturbaciones sean igualmente relevantes, sino que dirige el índice de robustez hacia las perturbaciones más probables.
CV también se puede aplicar para mediciones de una sola célula para evaluar la heterogeneidad de la población. De hecho, algunas subpoblaciones podrían exhibir una mayor solidez con respecto al promedio R, provocando una clasificación imprecisa de la cepa seleccionada [

  • Vasdekis AE
  • et al.
Obtener los impactos del ruido celular en las compensaciones metabólicas mediante imágenes cuantitativas de masas.

].

La cuantificación de la robustez microbiana será una medida fundamental para integrar en el análisis de datos masivos para optimizar los bioprocesos [

  • Gargalo CL
  • et al.
Hacia la biofabricación inteligente: una perspectiva sobre los desarrollos recientes en tecnologías de monitoreo y medición industrial para procesos de producción de base biológica.

]. Grandes conjuntos de datos se pueden utilizar como base para la inteligencia artificial emergente para predecir y controlar bioprocesos. En la producción de queso crema, se ha desarrollado una red neuronal artificial junto con un modelo mecánico para predecir el tiempo total de fermentación utilizando solo las concentraciones iniciales de biomasa, lactosa y ácido láctico como variables.

  • li b
  • et al.
Aplicación de modelado mecanicista y aprendizaje automático para la predicción del pH de la fermentación del queso crema.

]. Un marco híbrido que integra métodos basados ​​en datos con un modelo metabólico a escala del genoma demostró una precisión prometedora al predecir E. coli rendimiento en condiciones típicas de bioprocesos y vías disponibles [

  • Oyetunde T.
  • et al.
Marco de aprendizaje automático para la evaluación del rendimiento de la fábrica microbiana.

]. Grandes datos recopilados en procesos de fermentación (por ejemplo, de in situ biosensores [

  • Yakovleva M.
  • et al.
El termistor enzimático: un concepto realista de biosensor. Una revisión crítica.

], sensores espectroscópicos [

  • Samorski M.
  • et al.
Mediciones cuasi continuas combinadas de luz dispersa y fluorescencia: una nueva técnica de medición para placas de microtitulación agitadas.

] y sensores inalámbricos flotantes [

  • Bussé C.
  • et al.
Sensores para biorreactores desechables.

]), potencialmente almacenada en conjuntos de datos fenómicos, podría usarse para calcular la robustez de muchas cepas in silico, y posteriormente se han adoptado en el diseño de cepas y fermentaciones a gran escala. Los modelos mecánicos y basados ​​en datos, como la regresión de mínimos cuadrados parciales, podrían predecir cómo cambia la robustez en función de las perturbaciones internas y externas, por ejemplo, midiendo posibles marcadores de robustez. Por lo tanto, la cuantificación matemática de la robustez, junto con el aprendizaje automático y los grandes datos, podrían convertirse en jugadores importantes para guiar el diseño de la deformación.

Observaciones finales y perspectivas futuras

Una mejor integración y comprensión de la robustez en el diseño de la tensión y el proceso son fundamentales para resolver el cuello de botella que enfrentan las industrias de base biológica para llevar sus productos al mercado. El
La amplia aplicación de robustez en biotecnología probablemente inspirará enfoques novedosos, como la utilización de consorcios microbianos con interacciones dinámicas entre sus miembros (ver Preguntas pendientes) [

  • Kehe J.
  • et al.
Detección masivamente paralela de comunidades microbianas sintéticas.

,

  • campbell k
  • et al.
Las comunidades autoestablecidas permiten el intercambio cooperativo de metabolitos en un eucariota.

]. A diferencia de la tolerancia, la robustez microbiana es un concepto multidimensional. La robustez cubre la estabilidad de múltiples fenotipos (p. ej., relacionados con la producción), mientras que la tolerancia solo cubre el fenotipo relacionado con el crecimiento. Tanto la tolerancia como la robustez pueden referirse a perturbaciones únicas o múltiples. Sin embargo, para que un bioproceso sea robusto, la selección y el diseño de cepas deben considerar el conjunto colectivo de perturbaciones industriales.. Una estrategia común para mejorar la tolerancia y/o la producción de microorganismos para aplicaciones industriales es a través de la evolución de laboratorio adaptativa, mediante la cual la selección natural y las mutaciones actúan en sinergia bajo presión selectiva.

  • Sandberg TE
  • et al.
El surgimiento de la evolución adaptativa del laboratorio como una herramienta eficiente para el descubrimiento biológico y la biotecnología industrial.

,

Mans, r. et al. Bajo presión: ingeniería evolutiva de cepas de levadura para mejorar el rendimiento en la producción de combustibles y productos químicos. actual Opinión Biotecnología. 50, 47–56

]. Un sistema de evolución computacional mostró que las mutaciones adquiridas durante condiciones fluctuantes hicieron que una nueva cepa fuera más propensa a adaptarse a las condiciones encontradas anteriormente y diseñar adaptaciones futuras.

  • Canino-Koning R.
  • et al.
Los entornos fluctuantes seleccionan la variación fenotípica a corto plazo que conduce a la exploración a largo plazo.

]. Esto destaca la importancia de variar la naturaleza y la composición de las perturbaciones durante la evolución del laboratorio adaptativo para lograr cepas robustas capaces de enfrentar múltiples desafíos, en lugar de solo aumentar la dureza de una sola perturbación y mejorar la tolerancia.

Los esfuerzos en curso para modelar las complejas redes de interacciones que definen la robustez microbiana eventualmente proporcionarán un instrumento sólido y confiable para la caracterización y selección de fábricas de células industrialmente relevantes. Recientes técnicas unicelulares que revelan la dinámica de la población ofrecen nuevos conocimientos sobre los bioprocesos, así como características e indicadores clave del estado celular y/o del proceso. Por último, la cuantificación de la robustez, utilizada como herramienta para encontrar marcadores de robustez intracelular y como medida de la estabilidad del fenotipo, podría conducir a la elección de un microorganismo industrial altamente estable y eficaz. Aunque recién ahora estamos comenzando a comprender los complejos mecanismos detrás de la robustez, una comprensión completa allanará el camino para un diseño exitoso de cepas y bioprocesos.

¿Serán capaces las nuevas herramientas de análisis unicelulares de identificar nuevos rasgos/características/genes relacionados con la robustez para mejorar los procesos industriales?

¿Cómo se pueden utilizar los métodos de cuantificación de la robustez con fines industriales?

¿Son algunas perturbaciones más relevantes que otras para predecir la robustez de la deformación?

¿Qué papel juegan las subpoblaciones en los procesos robustos?

¿En qué medida se compensan los fenotipos de producción con la robustez?

¿Se puede diseñar la robustez con una combinación de modularidad, redundancia y control dinámico?

¿Cómo puede llevarse a cabo la transferencia a escalas más grandes con robustez asegurada?

Glosario

Cobertura de apuestas

una estrategia de supervivencia basada en la heterogeneidad fenotípica dentro de una población isogénica a granel en la que la variación intrínseca de célula a célula puede desempeñar un papel beneficioso frente a perturbaciones perjudiciales en el medio ambiente.

Control dinámico (CC)

un principio de robustez que se refiere al control de retroalimentación que los componentes del sistema ejercen sobre los procesos como resultado de las interacciones de la red dentro del propio sistema. Un ejemplo es la regulación por retroalimentación negativa que ejerce la glucosa-1-P sobre la expresión de la hexoquinasa 1.

Modularidad (M)

un principio de robustez que se refiere a la subdivisión de un sistema en módulos especializados para tareas específicas con el objetivo de optimizar los procesos del sistema. Un ejemplo es la compartimentación de una célula en diferentes orgánulos.

trastorno

cambio ambiental o genético que puede alterar el fenotipo de un sistema. Para mantener su funcionalidad y rendimiento, el sistema responde con ajustes fenotípicos. Las perturbaciones en los bioprocesos se pueden dividir en estocásticas y predecibles, según su naturaleza.

Fenotipo

características celulares observables únicas o múltiples (p. ej., rendimiento, tasa de crecimiento específica, volumen celular, etc.). Matemáticamente también denominadas funciones.

heterogeneidad fenotípica

un concepto de heterogeneidad de población que sigue a subpoblaciones con diferencias fenotípicas y de comportamiento dentro de la misma población de células isogénicas a granel. Tales diferencias pueden ser causadas por factores intrínsecos (p. ej., expresión génica diferencial) y/o factores extrínsecos (p. ej., diferentes gradientes fisicoquímicos de sustrato).

Redundancia (R)

un principio de robustez que se refiere al evento en el que el mismo proceso puede ser ejecutado por diferentes componentes dentro del sistema. Por ejemplo, la conversión de furfural en alcohol furfurílico en levadura puede realizarse tanto por ADH1 como por ADH5.

Robustez

la capacidad de un sistema para mantener el rendimiento sin cambios cuando se producen una o más perturbaciones. En un entorno industrial, la robustez microbiana se refiere a la capacidad del microbio para mantener un rendimiento de producción constante (definido como títulos, rendimientos y tasas) independientemente de las diferentes perturbaciones estocásticas e impredecibles que ocurren en un bioproceso.

Tolerancia

la capacidad de un microorganismo para sobrevivir cuando se expone a una o múltiples perturbaciones. Generalmente se describe solo por parámetros relacionados con el crecimiento (como la viabilidad o la tasa de crecimiento específica) y también se puede denominar resistencia.

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