Logotipo de Zephyrnet

Inteligencia de datos generativa

Biotecnología

Transcripción in vitro de nanopartículas de ADN autoensamblables – Informes cientificos

Reeditado por Platón
Reeditado por Platón

Fecha:

Vistas: 52

Se prepararon andamios de origami de ADN portadores de genes como se describió anteriormente.24, resumido de la siguiente manera.

PCR estándar

Los cebadores para la amplificación del gen de la proteína fluorescente verde (GFP) se diseñaron utilizando SnapGene y se adquirieron en Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA, EE. UU.). La secuencia de cada cebador se incluye en la tabla complementaria. 1. La polimerasa Phusion® para la reacción de PCR se adquirió de New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, EE. UU.).

Para la generación de un gen dúplex que contiene todos los componentes para la transcripción, cada mezcla de reacción de PCR se preparó en un volumen final de 50 µL, compuesta por 1 × tampón Phusion® HF (NEB), mezcla de dNTP (NEB) 200 nM, cebador sentido 500 nM ( T7EGFP sentido = cadena con sentido no deseado), cebador antisentido 500 nM (T7EGFP anti = cadena antisentido deseada), 10 ng de plantilla de plásmido (pCMV-T7-EGFP; Addgene, Watertown, MA, EE. UU.), 0.5 µL de ADN polimerasa Phusion® y nucleasa -agua libre al volumen. Cada PCR se realizó utilizando los siguientes pasos del termociclador: 30 s a 98 °C, 30 s a 58 °C y 1 min a 72 °C durante 30 ciclos24.

Para la generación de promotores faltantes de genes dúplex, cada mezcla de reacción de PCR se preparó en un volumen final de 50 µL, compuesta por 1 × tampón Phusion® HF (NEB), mezcla de dNTP 200 nM (NEB), cebador sentido 500 nM (RT-sentido) , cebador antisentido 500 nM (T7EGFP anti), 10 ng de pCMV-T7-EGFP (Addgene), 0.5 µl de ADN polimerasa Phusion® y agua libre de nucleasa hasta completar el volumen. Cada PCR se realizó utilizando los siguientes pasos del termociclador: 30 s a 98 °C, 30 s a 59 °C y 1 min a 72 °C durante 30 ciclos.24.

Los productos de reacción se mezclaron con 6 x colorante de carga (15% Ficoll®-400, EDTA 60 mM, Tris-HCl 19.8 mM, SDS al 0.48%, tinte 0.12 al 1%, tinte 0.006 al 2%, pH 8 a 25 °C; NEB ) y luego se cargó en un gel de agarosa al 1% previamente teñido con tinte de ADN seguro SYBR (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.). La electroforesis se realizó a 8 V/cm durante 1 h. El ADN que contiene SYBR Safe se visualizó utilizando un transiluminador de longitud de onda (azul) de 490 nm y un filtro ámbar.24.

PCR asimétrica (aPCR)

Los cebadores utilizados en aPCR fueron idénticos a los utilizados en PCR estándar. Junto con los cebadores sentido y antisentido, se utilizó un cebador modificado terminal 3' (bloqueador T3EGFP 7'). El bloqueador 3' T7EGFP se diseñó utilizando SnapGene y se compró a IDT. Su secuencia se incluye en la tabla complementaria. 1.

Para la generación de un andamio que contiene todos los componentes para la transcripción, cada reacción de aPCR se llevó a cabo en un volumen total de 50 µL, compuesto por 1 × tampón LongAmp® Taq (Tris-SO 60 mM).4, 20 mM (NHXNUMX4)2SO4, MgSO 2 mM4, 3 % glicerol, 0.06 % IGEPAL® CA-630, 0.05 % Tween® 20, pH 9.1 a 25 °C) de NEB, anti T500EGFP 7 nM, sentido T25EGFP 7 nM, bloqueador T475EGFP 3' 7 nM, mezcla dNTP 300 nM de NEB, 10 ng del gen GFP de doble cadena (dsT7EGFP; generado por PCR estándar), 2 µl de ADN polimerasa LongAmp® Taq (NEB) y agua libre de nucleasas hasta el volumen final. Cada aPCR se realizó utilizando los siguientes pasos del termociclador: 30 s a 94 °C, 30 s a 58 °C y 2 min a 65 °C durante 25 ciclos.24.

Para la generación de un andamio que contiene todos los componentes para la transcripción excepto el elemento promotor, cada reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen total de 50 µL, compuesto por 1 × tampón LongAmp® Taq (Tris-SO 60 mM).4, 20 mM (NHXNUMX4)2SO4, MgSO 2 mM4, 3 % de glicerol, 0.06 % de IGEPAL® CA-630, 0.05 % de Tween® 20, pH 9.1 a 25 °C) de NEB, 1 µM T7EGFP anti, 20 nM RT sense, mezcla de dNTP 300 nM de NEB, 10 ng de doble gen GFP hebrado desprovisto de promotores (dsT7EGFP -T7; generado mediante PCR estándar), 2 µL de ADN polimerasa (NEB) LongAmp® Taq y agua libre de nucleasa hasta el volumen final. Cada aPCR se realizó utilizando los siguientes pasos del termociclador: 30 s a 94 °C, 30 s a 59 °C y 2 min a 65 °C durante 25 ciclos24.

El producto de reacción se cargó en un gel de agarosa al 1% preteñido con 1 × SYBR Safe (Invitrogen), se sometió a electroforesis y se visualizó como se indicó anteriormente.

Purificación de ADN bicatenario (ADNbc)

Se utilizó un kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean (Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.) para extraer ADN bicatenario de geles de agarosa. Las bandas de gel que contenían ADNbc objetivo se eliminaron utilizando una hoja de afeitar limpia. Se añadió tres veces el volumen de la porción de gel del tampón de unión/disolución de agarosa proporcionado a cada fragmento de gel y se incubó a 55 °C en un bloque térmico durante 15 minutos. Cada solución de gel disuelto se transfirió a una columna de centrifugación a base de sílice proporcionada y se centrifugó a una fuerza centrífuga relativa (rcf) de 10,000 durante 60 s en una centrífuga de mesa. Se agregaron 200 µl de tampón de lavado de ADN a base de etanol a cada columna de centrifugación y se centrifugaron a 10,000 rcf durante 30 s. Se repitió un paso de lavado antes de centrifugar a 10,000 rcf durante 60 s para la eliminación completa del etanol. Se descartó el flujo continuo de todos los pasos. Después de transferir cada columna de centrifugación a un tubo de microcentrífuga limpio, se agregaron de 6 a 20 µl del tampón de elución proporcionado (Tris-HCl 10 mM, EDTA 0.1 mM, pH 8.5) directamente a la matriz de cada columna de centrifugación, seguido de una centrifugación a 10,000 60 rcf. durante 6 s para la recolección de ADN. Una fracción de cada ADNbc purificado se mezcló con 1 x tinte de carga (NEB) y se cargó en gel de agarosa al 1% preteñido con 8 x SYBR seguro (Invitrogen). El gel se ejecutó a 1 V/cm durante 19.1 h. El rendimiento de la muestra de ADNbc purificado se evaluó midiendo las intensidades de las bandas en relación con un control conocido utilizando GelAnalyzer XNUMX disponible en www.gelanalyzer.com (consultado el 19 de agosto de 2021)24.

Purificación monocatenaria (ssDNA)

Se utilizó un kit de recuperación de ARN en gel Zymoclean de Zymo Research para purificar el ADN ss de geles de agarosa. Las bandas de gel que contenían ssDNA objetivo se cortaron con una hoja de afeitar limpia. Se añadió tres veces el volumen de la porción de gel del tampón de unión/disolución de agarosa proporcionado a cada banda de gel extirpada y se fundió a 55 °C en un bloque térmico durante 15 minutos. Cada solución de gel disuelto se transfirió a una columna de centrifugación a base de sílice proporcionada y se centrifugó a 12,000 rcf durante 2 minutos. Se agregaron 400 µl de tampón de preparación de ARN a cada columna de centrifugación seguido de centrifugación a 12,000 rcf durante 1 min. El lavado se llevó a cabo mediante la adición de 800 µl de tampón de lavado a base de etanol seguido de una centrifugación a 12,000 rcf durante 30 s. Después de repetir el paso de lavado con 400 µl de tampón de lavado a base de etanol, cada columna de centrifugado se centrifugó a 12,000 rcf durante 2 minutos para eliminar el etanol residual. Se descartó el flujo continuo en todos los pasos. Después de transferir cada columna de centrifugación a tubos de microcentrífuga limpios, se agregaron directamente a la matriz de la columna de 6 a 20 µl del agua libre de nucleasa proporcionada y las columnas de centrifugación se centrifugaron a 10,000 1 rcf durante 6 minuto para la recolección del retenido. Una fracción de cada ADNss purificado se mezcló con XNUMX x colorante de carga (NEB) y el rendimiento se estimó mediante electroforesis en gel como se describe anteriormente.24.

Construcción de nanopartículas de ADN.

Las nanopartículas de ADN se diseñaron utilizando caDNAno (www.cadnano.org) y las grapas se compraron en IDT (Tablas complementarias 2 y 3). Las nanopartículas de ADN se prepararon mezclando el gen GFP monocatenario (ssT7EGFP o ssT7EGFP -T7; generado por aPCR) a una concentración final de 91.4 nM y cada grapa a una concentración final de 457 nM en 1 × tampón TAE suplementado con Mg 12.5 mM ( OAc)2 (TAEM) en un volumen final de 50 µL. El conjunto básico para cada nanopartícula de ADN se incluye en la tabla complementaria. 4. La mezcla se incubó a 90 °C durante 10 minutos en un baño de agua y luego se enfrió gradualmente hasta temperatura ambiente. Los productos de esta reacción se mezclaron con 6 x colorante de carga (NEB) y luego se cargaron en gel de agarosa al 1% que contenía Mg(OAc) 12.5 mM.2 preteñido con 1 × tinte SYBR Safe DNA (Invitrogen). La electroforesis se llevó a cabo en tampón TAEM a 6 V/cm durante 90 min. El gel se visualizó como arriba. El origami de ADN se purificó utilizando una columna giratoria de extracción en gel de ADN Freeze 'N Squeeze™ (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Las bandas de gel que contenían origami de ADN objetivo se cortaron y eliminaron usando una hoja de afeitar limpia, luego se transfirieron a columnas Freeze 'N Squeeze™ DNA Gel Extraction Spin. Las columnas de centrifugado que contenían rodajas de gel de origami de ADN objetivo se incubaron a -20 °C durante 5 minutos, seguido de una centrifugación a 13,000 rcf en una centrífuga de mesa durante 3 minutos a temperatura ambiente. La concentración de las muestras de origami de ADN purificadas se midió utilizando un instrumento NanoDrop™.

Transcripción in vitro (TIV)

Todas las reacciones IVT se llevaron a cabo en un volumen total de 20 µl utilizando un kit de síntesis de ARN rápido de alto rendimiento (NEB) HiScribe® T7. Cada reacción contenía 10 µl de mezcla de tampón NTP (10 mM cada NTP; NEB), 10 ng de plantilla de ADN (plásmido GFP linealizado (LpCMV-T7-EGFP), dsT7EGFP, ssT7EGFP, cada nanopartícula de ADN (designada como se describe en la Tabla 1 abajo y en la leyenda de la Fig. 2b), 2 l de mezcla de ARN polimerasa T7 y agua libre de nucleasa hasta completar el volumen. Cada reacción se llevó a cabo a 37 °C durante 2 h. Para T7GHL FS, T7GHL PO y T7GHL HS, se llevó a cabo un tiempo de reacción de 30, 60, 90 y 120 minutos para una comparación preliminar de las tasas de transcripción relativas de estas construcciones y la longevidad del sustrato.

Tabla 1 Nombres de los andamios de ADN y las nanopartículas de ADN utilizadas en este estudio.
Mesa de tamaño completo

Purificación de productos IVT

Después de IVT, se agregaron 30 µl de agua libre de nucleasas a cada producto de reacción de IVT para aumentar el volumen de reacción. Luego, cada producto IVT se purificó utilizando un kit de limpieza de ARN (NEB) Monarch®. Se añadieron 100 µl de tampón de unión a ARN a cada 50 µl de producto IVT seguido de la adición de 150 µl de etanol absoluto. Luego, cada mezcla se transfirió a una columna de centrifugación a base de sílice proporcionada y se centrifugó en una centrífuga de mesa. Se añadieron 500 µl de tampón de lavado de ADN a base de etanol a cada columna de centrifugación y se centrifugaron como anteriormente. La etapa de lavado se repitió una vez más y se descartó el flujo de todas las etapas. Cada columna de centrifugación se transfirió a un tubo de microcentrífuga limpio y se agregaron 10 µl del agua libre de nucleasas proporcionada directamente a la matriz de cada columna de centrifugación, seguido de una centrifugación para la recolección de ADN. Todos los pasos de centrifugación se llevaron a cabo a 16,000 rcf durante 60 s.

Evaluación de productos IVT

Los productos IVT de todas las muestras de ADN se analizaron mediante electroforesis en gel. Los productos de PCR de GFP purificada y IVT de plásmido de GFP linealizado se diluyeron 100 veces para evitar la tinción excesiva. Los productos de ARN purificados se mezclaron con un volumen igual de 2 x colorante de carga de ARN (95% de formamida, 0.02% de SDS, 0.02% de azul de bromofenol, 0.01% de xilenocianol, EDTA 1 mM; NEB). Las muestras se calentaron a 70 °C durante 10 minutos antes de cargar el gel. La electroforesis se realizó a 8 V/cm durante 1 h. Los geles se tiñeron posteriormente con una solución de TAE 1 × que contenía oro SYBR 1 × (Invitrogen) durante 2 h. Los geles teñidos se visualizaron utilizando un transiluminador de longitud de onda de 490 nm y un filtro ámbar.

PCR con transcripción inversa (RT-PCR)

Se prepararon plantillas de ARN para RT-PCR llevando a cabo una reacción IVT utilizando cada plantilla de ADN (LpCMV-T7-EGFP, dsT7EGFP, ssT7EGFP, T7GHL PO, T7GHL HS, T7GHL FS y T7GHL BP) como se describió anteriormente. Para minimizar la posible señal de fondo causada por la presencia de plantilla de ADN residual, se usó 1 ng de cada plantilla de ADN (en lugar de 10 ng) para estas reacciones y el tiempo de incubación se extendió hasta la noche para maximizar la producción de ARN en estas condiciones. Después de la IVT, el ADN se hidrolizó mediante tratamiento con ADNasa. Se preparó una mezcla de 50 µl de DNasa mezclando 20 µl de producto IVT con 2 µl de DNasa-I libre de RNasa y agua libre de nucleasa hasta completar el volumen. Todas las reacciones de DNasa se llevaron a cabo a 37 °C durante 30 min. Los productos de ARN tratados con ADNasa se purificaron utilizando un kit de limpieza de ARN Monarch® (NEB) como se describió anteriormente. Los cebadores para la amplificación del gen GFP se diseñaron utilizando SnapGene y se adquirieron en IDT. La secuencia de cada cebador se incluye en la tabla complementaria. 1. La RT-PCR se realizó utilizando un kit de RT-PCR de un solo paso (NEB) OneTaq®. Cada mezcla de RT-PCR se llevó a cabo en un volumen final de 50 µL, que contenía 1 × mezcla de reacción de un solo paso Quick-Load® OneTaq (MgCl 1.6 mM).2, mezcla de dNTP 250 nM), cebador sentido 400 nM (RT-sentido), cebador antisentido 400 nM (RT-anti), 1 µL de cada producto de ARN purificado, 1 × mezcla de enzimas de un solo paso OneTaq® (transcriptasa inversa ProtoScript® II , ADN polimerasa OneTaq® Hot Start, inhibidor y estabilizador de la ARNasa murina) y agua libre de nucleasas hasta completar el volumen. Para evaluar cualquier contribución a la señal de PCR del ADN residual resultante de la hidrólisis incompleta de la ADNasa, se prepararon controles negativos en paralelo. Estas reacciones contenían los mismos componentes que las mezclas de RT-PCR, pero sustituyeron la mezcla de enzimas OneTaq® One-step por la ADN polimerasa OneTaq® Hot Start (es decir, carecían por completo de transcriptasa inversa). En este caso, cualquier señal representó la amplificación del ADN residual que quedó después del tratamiento con ADNasa. Las reacciones se llevaron a cabo tratando cada mezcla de RT-PCR a 48 °C durante 30 minutos seguido de PCR. Cada PCR se realizó utilizando los siguientes pasos de termociclado: 30 s a 94 °C, 30 s a 60 °C y 1 min a 68 °C durante 15 ciclos. Cada producto se cargó en un gel de agarosa al 1% previamente teñido con tinte de ADN seguro para SYBR (Invitrogen). El gel se sometió a electroforesis y se visualizó como anteriormente.

Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

TEM se realizó como se describió anteriormente.25. Brevemente, se prepararon muestras para imágenes TEM en un rango de concentración de 0.5 nM a 5 nM. Se colocaron 12 μl de la muestra en rejillas TEM de cobre de malla 400 recubiertas de carbono con descarga luminosa. Después de dos minutos de incubación, la solución de muestra se eliminó usando papel de filtro y se reemplazó con 12 μl de solución de tinción negativa de formato de uranilo recién preparada. La mancha se eliminó después de 30 s y las rejillas se secaron al aire. Las imágenes TEM se adquirieron con un aumento de 25,000 1230 × utilizando un TEM JEOL 2 (Peabody, Ma, EE. UU.) equipado con una cámara Ultrascan 2 k × XNUMX k Gatan Inc. (Pleasanton, CA, EE. UU.)25.

punto_img

Información más reciente

punto_img

Derechos de autor @ 2024 Plato Technologies Inc.