Animales

Se compraron ratas hembra Sprague Dawley (SD) (edad, 8~10 semanas; peso, 180~200 g) y ratones C57BL/6 (mitad macho y hembra; edad, 8~10 semanas; peso, 15~20 g) de el Centro de animales de laboratorio médico de Guangdong y alojados en condiciones estándar libres de patógenos específicos (SPF). Todos los animales se criaron en un gallinero libre de patógenos específicos (SPF) en un ambiente regulado estándar (ciclo de luz/oscuridad de 12 h) con libre acceso a alimentos y agua, y se les permitió aclimatarse durante al menos siete días antes de los experimentos. Los animales se asignaron aleatoriamente a diferentes grupos experimentales y no se utilizó ningún método de enmascaramiento durante el procedimiento experimental. Todos los procedimientos experimentales con animales que utilizaron animales de laboratorio se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Consejo Nacional de Investigación, 1996) y fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado de animales de la Universidad Sun Yat-sen (SYSU-IACUC-2021). -000438).

Cultura y diferenciación de los NSC

Las NSC se obtuvieron del cerebro fetal de ratas SD embrionarias de 14 días. Brevemente, se diseccionó el cerebro de los embriones y se extirparon bajo un microscopio la piamadre que los recubría y los vasos sanguíneos. Luego, el cerebro se disoció mecánicamente en solución salina tamponada con fosfato (PBS) preenfriada para generar una suspensión unicelular y se centrifugó a 1000 revoluciones por minuto (rpm) durante 10 min. El sedimento celular se resuspendió y se cultivó con medio DMEM/F-12 (Gibco, Life Technologies, EE. UU.) suplementado con suplemento B-2™ al 27 % (50X; Gibco, Life Technologies, EE. ; Peprotech, Nueva Jersey, EE. UU.), 20 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF; Peprotech, Nueva Jersey, EE. UU.) y penicilina/estreptomicina al 20% (1 U/ml, Gibco, Life Technologies, EE. UU.). Las NSC se purificaron mediante pases cada tres días, y las células entre los pases 10,000 y 2 se seleccionaron para realizar más investigaciones. Todas las células se analizaron para la contaminación por micoplasma cada 5 meses.

Para la diferenciación de NSC, los sedimentos de células se digirieron en células individuales con Accutase (Millipore, Bedford, MA) y se sometieron a diferenciación neuronal en placas de cultivo recubiertas con poli-L-lisina al 0.1% (Gibco, EE. UU.) en Neurobasal (Gibco, Life Technologies). , USA) suplementado con 2% B-27™. El medio se cambió cada 2~3 días.

Cultivo e inducción de astrocitos.

Se aislaron astrocitos de ratas SD postnatales de dos días. Después de eliminar las meninges y los vasos sanguíneos, las cortezas se disociaron mecánicamente y luego enzimáticamente en una suspensión unicelular con tripsina al 0.25 % a 37 °C durante 15 min, seguido de filtración y centrifugación para recolectar sedimentos celulares. Las células se suspendieron con medio basal (DMEM/F-12; suero bovino fetal al 10 %, FBS) y se sembraron en placas sin recubrir durante 30 min para eliminar los fibroblastos y las células endoteliales. Posteriormente, los astrocitos no adherentes se transfirieron a nuevos platos pre-recubiertos con 0.1% de poli-l-lisina. El medio celular se cambió cada tres días y se pasó cuando la tasa de fusión celular alcanzó ~90%. Los astrocitos se agitaron a 200 rpm durante la noche para eliminar la microglía de la capa superior que estaba adherida a la superficie de los astrocitos, y luego se administró PLX5622, un eliminador de microglía específico, para purificar aún más los astrocitos antes del paso. Todas las células se analizaron para la contaminación por micoplasma cada 3 meses. Para inducir astrocitos reactivos, las células se incubaron con los factores triples TNFα (30 ng/ml), IL-1α (3 ng/ml) y C1q (400 ng/ml) durante 24 h y se verificó la inducción exitosa de astrocitos reactivos mediante C3 altamente aumentado⁺ formación de astrocitos mediante tinción inmunofluorescente y ensayo de citometría de flujo.

Sobreexpresión de UCHL1 mediada por lentivirus

El lentivirus que sobreexpresa UCHL1 (OE-UCHL1-LV) y el vector lentiviral vacío (NC-LV) fueron construidos por HanBio Technology (Shanghai, China). Los lentivirus diseñados para sobreexpresar UCHL1 se clonaron en el vector lentiviral pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-GFP-T2A-PURO que contiene el gen informador ZsGreen. Los vectores de lentivirus se transfirieron a células T 293 en presencia de plásmidos de empaquetamiento (psPAX2 y pMD2G) utilizando LipofiterTM (Tecnología HanBio) para el empaquetamiento de lentivirus. Se transfectaron 293 células T y se evaluó la eficacia de la sobreexpresión después de 48 h mediante qPCR. El título final del vector lentiviral fue de 2 × 10⁸ UT/ml.

Para la infección de NSC, las células se transfectaron con una solución lentiviral diluida con una multiplicidad de infección (MOI) de 25, con un suplemento de 1 mg/ml de polibreno. A las 24 h después de la transfección, el medio se reemplazó con medio basal fresco (sin FBS) sin penicilina/estreptomicina durante otras 24 h. La expresión de GFP se visualizó bajo un microscopio fluorescente a las 48 h después de la transfección, y la sobreexpresión de UCHL1 se determinó mediante análisis de Western blot y qPCR.

Cocultivo de NSC y astrocitos

Aquí se realizaron dos sistemas de cocultivo in vitro (Fig. 4C): (1) Utilizamos un sistema transwell que permitía la interacción a través de factores difusibles. Los astrocitos de control no estimulados o los astrocitos reactivos en el transwell estaban en la parte superior de las NSC cultivadas en la cámara inferior, y ambas células se cultivaron dentro del medio de cultivo basal (sin FBS) de las NSC. (2) una transferencia de medio condicional de astrocitos simple (ACM) de los cultivos de astrocitos Control/Reactivos a los cultivos de NSC. Después de la incubación en el medio normal o inductor, los astrocitos se cultivaron con el medio de cultivo basal (libre de FBS) de NSC durante otras 24 h, luego se recolectaron los ACM de los astrocitos de control o astrocitos reactivos y se agregaron al medio basal de NSC en una proporción de 1: 1 ACM a medio de cultivo NSC. La proliferación celular, la formación de agresomas y la actividad del proteasoma se evaluaron 24 h después.

Ensayo de proliferación celular

La proliferación celular in vitro se examinó mediante la incorporación de EdU. Las NSC se incubaron con un medio de cultivo suplementado con EdU 10 µM durante la noche antes de la recolección. Las células se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4 % seguido de permeabilización, luego se lavaron dos veces con albúmina de suero bovino (BSA) al 3 % y se tiñeron con el kit de ensayo Click-iT EdU (US Everbright INC.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de lavarlas una vez, las células se resuspendieron con solución de Hoechst (2 µg/ml; US EVERBRIGHT INC.) para la contratinción de ADN antes del análisis en Cytoflex LX o microscopio confocal de barrido láser (LSCM). Las células de control que no se sometieron a EdU pero se sometieron a detección de EdU fluorescente se usaron como base negativa para evaluar los valores de corte para la positividad de EdU. Para la cuantificación del ensayo EdU, la proporción de EdU⁺ Se contaron las células en al menos tres réplicas entre diferentes grupos.

Análisis de proteostatos

Las células se fijaron como se mencionó anteriormente, luego se permeabilizaron con Triton X-0.5 al 100 %/PBS en hielo y se agitaron suavemente durante 30 min. Después de lavarlas dos veces con PBS, las células se resuspendieron con el reactivo de detección de agresomas PROTEOSTAT (1:2000) y se protegieron de la luz a temperatura ambiente (TA) durante 30 min, y posteriormente se contratiñeron con Hoechst 33342 (1:1000). Las células teñidas se analizaron utilizando un microscopio confocal. Para la citometría de flujo, se aplicaron 500 µl de reactivo de detección de agresivos PROTEOSTAT 1:10000 recién diluido para incubar las células durante 30 min bajo protección de la luz. Se realizaron como controles un ensayo de privación de nutrientes que eliminó el proteostato y un inhibidor del proteasoma. MG132, un inhibidor del proteasoma que acelera la formación de agresomas perinucleares dentro de las células, se utilizó como control positivo. Para la privación de nutrientes, las células se incubaron en HBSS (Gibco) suplementado con HEPES 1 mM que evitó la acidificación excesiva durante 3 h, luego se reemplazó el medio con medio de cultivo basal. El marcaje de proteostatos se determinó mediante el área de fluorescencia relativa del agresoma proteico en el mismo campo de visión en diferentes tratamientos, con al menos tres réplicas biológicas.

Ensayo de actividad de proteasoma

Los ensayos de actividad de proteasoma se realizaron mediante una sonda de actividad de proteasoma de acuerdo con las instrucciones. Las células tratadas se incubaron con la sonda de actividad de proteasoma 5 µM Me4BodipyFl-Ahx3Leu3VS (Boston Biochem) durante 2 ha 37 °C, luego se lavaron y analizaron mediante citometría de flujo.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

El nivel de C3a en sangre periférica y LCR recolectado de ratas SCI se detectó a través del kit RayBio huMan C3a ELISA (RayBiotech) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadieron 100 µl de estándar o muestra a cada pocillo y se incubaron 2.5 ha TA con agitación suave, luego se lavaron cuatro veces y se incubaron con anticuerpo biotinilado durante 1 h. Posteriormente se añadieron 100 µl de estreptavidina conjugada con HRP, seguido de la incubación del reactivo de sustrato de un solo paso de 3,3,5,5′-tetrametilbencidina (TMB) durante 30 min a TA en la oscuridad con agitación suave. Finalmente, terminando la acción con solución de parada y se midió y registró inmediatamente el valor de absorbancia a 450 nm.

Modelo de lesión de la médula espinal y administración de lentivirus

Para producir un modelo de rata de la transección completa de la 10ª vértebra torácica (T10) SCI, se anestesiaron ratas hembra SD y se afeitó el pelaje del dorso y se desinfectó con torunda de yodo-voltios. Se realizó una incisión de aproximadamente 2 cm en la piel T9-T11, luego se separó sucesivamente la grasa, la capa de fascia y los músculos paravertebrales para exponer la vértebra T10. Luego se realizó laminectomía T10 y se seccionó completamente el tejido espinal T10 usando un bisturí afilado. Después de la hemostasia, las ratas se dividieron al azar en seis grupos y se inyectó un total de 10 μl de mezcla específica en el sitio de la lesión usando una microjeringa de acuerdo con los grupos de animales de la siguiente manera: grupo simulado (sin SCI; n = 12); grupo de control de lesiones (PBS; n = 12); vector lentiviral vacío (NC-LV; 2 × 10⁸ UT/ml; n = 12); vector lentiviral que codifica UCHL1 (OE-UCHL1-LV; 2 × 10⁸ UT/ml; n = 12) grupo; UCHL1 humano recombinante (rh-UCHL1; 4 μm; n = 12) grupo; y el LDN-57444 (inhibidor de UCHL1; 2 mM; n = 12) grupo. Se mezcló por separado un total de 5 µl de virus o proteína recombinante con 5 µl de Matrigel antes de inyectarlos en las lesiones de ratas SCI para evitar pérdidas.

La temperatura corporal de los animales se mantuvo a ~37 °C usando una almohadilla térmica durante toda la cirugía hasta que se recuperaron por completo de la anestesia. Durante el cuidado postoperatorio, los animales se sometieron a evacuaciones vesicales manuales hasta la restauración de la micción autónoma y controles diarios de heridas, infección, pérdida de peso, autofagia de los dedos y movilidad. Ninguno de los animales utilizados en este experimento mostró infección de la herida, erosión o heridas autoinducidas.

Construcción e inyección de virus adenoasociados (AAV)

OBiO Technology Corp. Ltd ( Llevar a la fuerza). El gen UCHL1 se subclonó en plásmidos pAAV-Nestin-tdTomato-P2A-3xFLAG-WPRE para producir pAAV-Nestin-tdTomato-P1A-2xFLAG-Uchl3-tWPA. El título del virus fue de 1E + 2 genomas de vector por ml (VG/ml) determinado por qPCR. Las ratas SD hembra se sometieron a la SCI de transección completa T3 como se describió anteriormente, luego se administró el virus (2 μl en volumen) en el centro de la lesión con una microjeringa inmediatamente después de la cirugía. Los animales se sacrificaron dos semanas después de la inyección del virus para su posterior análisis.

ensayo BrdU

La activación de las NSC en la médula espinal se evaluó mediante BrdU (5-bromodesoxi-2′-desoxiuridina; Sigma) después de la inyección de AAV. A las ratas SCI a las que se administró AAV se les inyectó intraperitonealmente BrdU (30 mg/kg de peso corporal) diariamente después de la cirugía durante 2 semanas hasta la eutanasia. Se recogieron las médulas espinales lesionadas y se prepararon secciones congeladas (10 µm) en un criostato. Las secciones se pretrataron con HCL 2 M durante 30 min a 37 °C, seguido de ácido bórico 0.1 M (pH 8.5) (Biosharp) durante 10 min a temperatura ambiente. Luego, las secciones se bloquearon, se incubaron con el anticuerpo primario anti-BrdU y anti-Nestin (1: 1000; Sigma) durante la noche a 4 ° C y los anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Flour 488/647 posteriormente, y se contrastaron con DAPI antes de la observación.

Bloqueo de astrocitos reactivos y vía C3/C3aR en ratones SCI

Para bloquear los astrocitos reactivos después de SCI usando anticuerpos neutralizantes [30], se seleccionaron ratones C57BL/6 en lugar de ratas SD para realizar el experimento de transección T10 debido a la gran demanda de anticuerpos neutralizantes in vivo. Espere para el grupo Sham (sin LME; n = 12), todos los ratones se sometieron a una SCI de transección T10 completa y se les inyectaron anticuerpos neutralizantes triples (grupo de Abs neutralizantes; TNFα/IL-1α/C1q, 10 mg/kg cada uno; n = 12), el anticuerpo IgG de control (grupo IgG; 10 mg/kg; n = 12) y solución salina normal al 0.9 % (grupo de control de lesiones; n = 12) mediante inyección intraperitoneal cada dos días. Para bloquear la vía C3/C3aR, se inyectó por vía intraperitoneal antagonista de C3aR (SB290157; 10 mg/kg) o solución salina normal al 0.9 % en ratones SCI o Sham diariamente. Y los animales fueron tratados con EdU (50 mg/kg) para rastrear las NSC proliferadas. A los 7 días posteriores a la lesión, se sacrificaron todos los animales para evaluar la activación de NSC.

Prueba de comportamiento

La prueba de calificación locomotora Basso, Beattie & Bresnahan (BBB) ​​[36] se realizó 2 días antes de la lesión, 1~3 días y semanalmente después de la cirugía para evaluar las funciones motoras de las extremidades posteriores. Las ratas se colocaron en un lugar tranquilo y abierto para garantizar el movimiento espontáneo, luego se observaron y registraron la marcha y las actividades físicas de las patas traseras. La escala BBB consta de tres partes: I. el movimiento de las articulaciones de las extremidades posteriores, que obtuvo una puntuación de 0 a 7; II. la marcha y la función de coordinación de las extremidades traseras, que obtuvieron una puntuación de 8 a 13; tercero la finura de la pata en movimiento, que puntuó 14~21. La evaluación del comportamiento se realizó semanalmente después de la SCI por dos investigadores familiarizados con los criterios BBB, por separado.

Examen de electrofisiología

La evaluación electrofisiológica se llevó a cabo como se describió previamente [37, 60] a las 8 semanas después de la SCI en ratas o 6 semanas después de la lesión en ratones. Los animales se volvieron a anestesiar y se realizó una laminectomía para exponer la médula espinal T7 y T13, que son tres segmentos rostrales y caudales al sitio de la lesión. Se colocó un electrodo de estimulación bipolar con una separación de 2 mm en el segmento T7 rostral intraespinal y se colocó un electrodo de bola de plata en el segmento caudal T13 para registrar la respuesta evocada. Se administró un pulso de onda cuadrada de 0.1 ms a intervalos de 10 ms y se amplificó y registró la actividad de campo. Se promediaron al menos 20 senderos de cada sitio de registro y se cuantificó la amplitud del potencial evocado.

Matriz de proteínas de líquido cefalorraquídeo de animales SCI

Se extrajo líquido cefalorraquídeo (LCR) mediante paracentesis de la cisterna cerebelomedular. Brevemente, a las 6 h después de la transección completa de T10 SCI, las ratas (n = 4) fueron re-anestesiados y fijados con un aparato estereotáxico. Luego se expuso la protuberancia occipital y se insertó cuidadosamente un capilar de vidrio en la cisterna cerebelomedular a través del hueso occipital. Se recogieron aproximadamente 100~120 μl de LCR de cada rata y se mantuvieron a -80 °C para una mayor investigación. Muestras de LCR de igual número de ratas (n = 4) sin cirugía se utilizaron como control.

Los análisis de micromatrices de proteínas de LCR recolectado de ratas normales/SCI se realizaron mediante G-Series Rat Cytokine Array (RayBiotech, Inc., Guangzhou, China) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Se utilizó un total de 100 μl de muestra de cada rata y los datos brutos obtenidos se restaron y normalizaron en segundo plano antes del análisis de agrupamiento. Se aplicó la anotación de ontología génica (GO), que consta de tres partes, incluida la función molecular, el proceso biológico y el componente celular, para identificar las funciones de los genes potenciales. Las posibles vías de señalización involucradas fueron analizadas por la base de datos de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG).

Tinción inmunofluorescente

Para el análisis inmunocitoquímico, las células se fijaron con PFA al 4 % y se permeabilizaron usando Triton X-0.5 al 100 %, luego se bloquearon en BSA al 5 % durante 1 hora a temperatura ambiente. Para la inmunohistoquímica, los animales se perfundieron con solución salina normal al 0.9 % seguida de PFA al 4 % en PBS 0.1 M (pH 7.2), luego un segmento espinal de 2~3 cm que abarca el centro de la lesión, con 2 segmentos arriba (+4 mm) y 2 abajo (-4 mm), se diseccionó y extrajo. Las muestras se posfijaron durante 6~8 horas y se deshidrataron en sacarosa al 20% y al 30% durante 3 días sucesivamente. Después de incluirlos en Tissue-Tek OCT (Sakura), los cortes longitudinales (10 μm) que abarcan el centro de la lesión y las secciones transversales (10 μm) del epicentro de la lesión T10 se recogieron en un criostato y se almacenaron a -20 °C para su uso posterior. . Las secciones congeladas de la médula espinal se lavaron en PBS durante 15 min y, posteriormente, se sometieron a recuperación de antígeno utilizando proteinasa K y bloqueo con BSA al 5 % suplementado con Triton X-0.3 al 100 % durante 2 horas. Después del procedimiento de bloqueo, las células fijadas y los cortes se incubaron con los primeros anticuerpos durante la noche a 4 °C. Los primeros anticuerpos utilizados en el presente estudio incluyeron: UCHL1 (1:300; Tecnología de señalización celular, CST), Nestin (1:300; Tecnología de señalización celular, CST), SOX2 (1:300; Abcam), Proteína ácida fibrilar glial ( GFAP; 1:300; Tecnología de señalización celular, CST), Proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2; 1:300; Abcam), Neurofilamento 200 (NF-200; 1:300; Tecnología de señalización celular, CST), CNPasa (1:300 ; Cell Signaling Technology, CST), NeuN (1:300; Abcam), C3a (1:10; Abcam), C3aR (1:200; Santa Cruz), NG2 (1:200; Santa Cruz), Doublecortin (DCX; 1:300; Abcam), Ki-67 (1:800; Abcam), Tubulin β3 (1:300; Tecnología de señalización celular, CST), BrdU (1:1000, Sigma). Después del lavado en PBS tres veces, las células y las secciones se incubaron posteriormente con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Flour 488/594/647 y se contrastaron con DAPI (1:5000; Sigma). Todas las imágenes de inmunofluorescencia se adquirieron utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM 880.

Cuantificación del análisis confocal

Todas las imágenes confocales de las células y los tejidos espinales se examinaron utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM 880 y se cuantificaron de manera ciega como se indica a continuación. Se seleccionaron 4~5 secciones de la médula espinal de diferentes niveles (incluyendo el dorsal, el medio y el ventral) en cada rata/ratón. Las secciones utilizadas para la cuantificación se seleccionaron del mismo nivel entre grupos en la medida de lo posible en diferentes condiciones. Las imágenes para la cuantificación se capturaron principalmente desde el sitio de la lesión en las secciones longitudinales y rodeando el canal central en las secciones transversales de los animales SCI. En la Fig. 6A. Cada punto de datos representa un experimento repetido una vez o adquirido de una rata/ratón. Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces con réplicas biológicas.

Para cuantificar las células positivas para UCHL1 en el sitio de la lesión de la médula espinal, se contó el porcentaje de señales DAPI rodeadas por UCHL1. Para cuantificar el C3⁺ astrocitos reactivos, SOX2⁺ NSC, NSC proliferados y neuronas in vitro e in vivo, C3/GFAP⁺, Ki-67/Nestín⁺, SOX2/Nestín⁺, BrdU/Nestín⁺, BrdU/tubulina β3⁺ las células de doble tinción se contaron manualmente en el mismo campo de visión y se cuantificó la proporción de células positivas. Para cuantificar la GFP⁺ células infectadas por el vector lentiviral que codifica UCHL1 en el centro de la lesión in vivo, doble tinción de GFP/Nestin⁺ NSC, GFP/NG2⁺ OPC, GFP/tubulina β3⁺ neuronas, GFP/NeuN⁺ neuronas y GFP/GFAP⁺ astrocitos se contó manualmente, y la proporción de células individuales a la de la GFP total⁺ se calcularon las celdas, respectivamente. Para cuantificar la inmunorreactividad de Nestin y NF-200, se midió el área fluorescente relativa de Nestin/NF-200 en el centro de la lesión de la sección óptica individual utilizando la Imagen J.

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR)

El ARN total de NSC o tejidos de la médula espinal se extrajo utilizando Trizol (Invitrogen, tecnologías de vida) de acuerdo con la especificación del reactivo. La cantidad de producción de ARN se determinó mediante el Nanodrop one (ThermoFisher). El ARN total se sometió a transcripción inversa en ADNc utilizando el kit de reactivos PrimeScript RT (Vazyme). El ensayo de Q-PCR se realizó con SYBR Premix EX Taq (Vazyme). Los niveles de expresión se normalizaron a los de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). La expresión relativa de los genes se calculó como cambios de pliegue utilizando el método 2−ΔΔCt. Las secuencias de los cebadores para los genes son las siguientes. Uchl1, Cebador directo (5′–3′): TGAAGCAGACCATCGGGAAC, Cebador inverso (5′–3′): GAGTCATGGGCTGCCTGAAT; Uchl3, Cebador directo (5′–3′): GGTCAGACTGAGGCACCAAG, Cebador inverso (5′–3′): CTCATCAGGGTCGCGCTC; Uchl5, Cebador directo (5′–3′): AGACCTTAGCAGAACACCAGC, Cebador inverso (5′–3′): CAGCAGTGTACACATGTCCAAAT; gapdh, Cebador directo (5′–3′): TGATTCTACCCACGGCAAGTT, Cebador inverso (5′–3′): TGATGGGTTTCCCATTGATGA.

Western blotting

Se realizó Western blot para detectar el enriquecimiento de proteínas en células y tejidos espinales. En resumen, las células y aproximadamente 1 cm de tejido espinal que contenía el sitio de la lesión se lisaron en PIPA (Solarbio) complementado con PMSF (1:100; Solarbio) y división ultrasónica en hielo. Se corrió un total de 20 µg de proteína en gel de electroforesis de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio al 10-12 % (SDS-PAGE), se transfirió a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF; Millipore, Mississauga, Canadá) y se bloqueó con leche descremada al 5 %. Luego, las membranas se incubaron con los primeros anticuerpos durante la noche a 4 ° C con agitación suave, seguido de una combinación con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (1: 1000). El enriquecimiento de proteínas se visualizó a través del reactivo de quimioluminiscencia y el análisis de bandas en escala de grises se determinó utilizando la Imagen J. Los primeros anticuerpos aplicados en este estudio son los siguientes: UCHL1 (1:1000; Cell Signaling Technology, CST), proteasoma 20S (1:1000; Affinity Biosciences LTD), Ubiquitina (1:1000; Abcam), Nestin (1:1000; Tecnología de señalización celular, CST), GFAP (1:1000; Tecnología de señalización celular, CST), MAP2 (1:1000; Abcam), NF- 200 (1:1000; Tecnología de señalización celular, CST), C3a (1:1000; Abcam), C3aR (1:500; Santa Cruz), Etiqueta DYKDDDDK (1:1000; Tecnología de señalización celular, CST), GAPDH (1: 1000, Beyotime Biotechnology), β-actina (1:1000, Beyotime Biotechnology). GAPDH y β-actina se usaron como controles internos.

Estadística

Se aplicó SPSS (Versión 20.0; Abbott Laboratories, Chicago, IL) para el análisis estadístico. Estudiante independiente, no emparejado de dos colas t Se utilizó la prueba para las comparaciones entre los dos grupos. Para las comparaciones múltiples, se seleccionó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido del análisis post hoc Tukey HSD o la prueba de Kruskal-Wallis con análisis de corrección de Bonferroni. Y se realizó ANOVA de dos vías con Tukey HSD para el análisis de puntajes BBB. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Los animales fueron asignados aleatoriamente a grupos experimentales. No se utilizó ningún método de enmascaramiento durante el procedimiento experimental. No hubo criterios de exclusión de animales. La varianza fue similar entre los grupos que se compararon estadísticamente. Todos los datos se presentaron como media ± el error estándar de la media (SEM) y P < 0.05 se consideró estadísticamente significativo.

• Distribución de relaciones públicas y contenido potenciado por SEO. Consiga amplificado hoy.
• PlatoData.Network Vertical Generativo Ai. Empodérate. Accede Aquí.
• PlatoAiStream. Inteligencia Web3. Conocimiento amplificado. Accede Aquí.
• PlatoESG. Automoción / vehículos eléctricos, Carbón, tecnología limpia, Energía, Ambiente, Solar, Gestión de residuos. Accede Aquí.
• Desplazamientos de bloque. Modernización de la propiedad de compensaciones ambientales. Accede Aquí.
• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41419-023-06003-8