Productos químicos y materiales

El trihidrato de tetracloroaurato de hidrógeno, nitrato de plata, ditiobis (propionato de succinimidilo), ácido 11-mercaptoundecanoico (MUA) y MMC se adquirieron de Sigma-Aldrich. El ácido ascórbico de grado analítico se obtuvo de MP Biomedicals. Clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida y N-hidroxisulfosuccinimida se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific. Se utilizó un sistema de agua Milli-Q para generar agua ultrapura (18.2 MΩ·cm) para sintetizar las nanopartículas. Se utilizaron dos productos LFA disponibles comercialmente adquiridos de Abbott (ARTG n.° 345192) y SD Biosensor (ARTG n.° 345219) para analizar las muestras clínicas siguiendo las instrucciones de los proveedores.

Producción de proteínas de fusión SpyCatcher, SpyTag y SCV2 RBD-mNeonGreen

Para producir SpyCatcher y SpyTag, las fusiones SpyCatcher-MatterTag y EGFP-SpyTag se diseñaron a través de un enlazador rígido (AEAAAKEAAAKEAAAKA) y un enlazador flexible (GGGS), respectivamente. Los genes quiméricos se sintetizaron comercialmente y se clonaron en el vector pCDNA3.1. Las proteínas de fusión se expresaron en células ExpiCHO-S según las instrucciones del fabricante (Thermo Fisher Scientific). Para la purificación, el sobrenadante filtrado se cargó en una columna Strep-Tactin 4Flow (IBA Lifesciences) equilibrada con un tampón de purificación (Tris-HCl 100 mM (pH 8.0), NaCl 150 mM). A continuación, la columna se lavó con 50 volúmenes de columna de tampón de purificación. La proteína de fusión se eluyó mediante un tampón de purificación que contenía biotina 50 mM (IBA Lifesciences). Las purezas de las proteínas purificadas se analizaron en electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida. La expresión y purificación de la proteína de fusión SCV2-mNeonGreen se describe en otra parte².

Ingeniería de células de levadura y producción de SynBioNF multifuncionales

Se emplearon células de levadura EBY100 para mostrar ocho proteínas de fusión funcionales diferentes en las paredes celulares, incluidas (1) W25–MatterTag, (2) Sb68–SpyTag, (3) Sb68–MatterTag, (4) Nb21–StrepTag, (5) Nb21 –SpyTag, (6) Nb21–MatterTag, (7) DD7–MatterTag y (8) DD5–SpyTag. Estas secuencias de genes de fusión se sintetizaron y clonaron comercialmente (Gene Universal; Datos complementarios 1 y 2) en el plásmido de expresión pCTCON2 para la visualización de la superficie de la levadura siguiendo el trabajo anterior². En nuestro diseño, los nanocuerpos de unión al objetivo (Sb68, W25 y Nb21) y las etiquetas peptídicas funcionales (MatterTag, SpyTag y StrepTag) se fusionaron en los extremos N y C de Aga2p, respectivamente. Se usó un enlazador flexible (GGGGS) con 15 y 30 aminoácidos en los extremos N y C de Aga2p para evitar obstáculos estéricos entre las proteínas/péptidos fusionados. Además, se incluyeron etiquetas peptídicas HA y c-Myc que permiten la cuantificación de las proteínas de fusión mostradas en los extremos N y C de cada construcción génica, respectivamente. Las proteínas de fusión que transportaban Aga2p pudieron inmovilizarse en las paredes de las células de levadura al interactuar con la proteína de anclaje Aga1p.

Para lograr la visualización de la proteína de fusión, se incubaron células de levadura EBY100 con ADN recombinante (10 µl, 1,000 ng) bajo la estimulación de una onda cuadrada mediante electroporación. Las células de levadura producidas se cultivaron en medio SDCAA y se monitorearon hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD600) alcanzó 5–10. A continuación, las células de levadura se transfirieron a medio SGCAA que contenía galactosa y se diluyeron a una DO600 de 1.0 para inducir la expresión de la proteína de fusión. Después del cultivo durante 48 h, se recogieron las células de levadura y se confirmó la expresión de la proteína de fusión realizando un análisis de citometría de flujo, como se describe a continuación.

Para la preparación de SynBioNF, las células de levadura con la presentación de proteínas de fusión se recolectaron del medio SGCAA (50 ml, OD600 de 6–10) y se lavaron con PBS mediante centrifugación (2,000 ×g, 10 min), seguido de resuspensión en PBS suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasa con EDTA (10 ml por tableta). La fragmentación mecánica de las células de levadura se llevó a cabo utilizando un sonicador (procesador ultrasónico Sonics VC-505) con una punta de 3 mm de diámetro y 171 mm de longitud a una intensidad ultra alta repitiendo cinco veces las siguientes condiciones: 40% de amplitud; Pulso de 1 s ON y 1 s OFF durante 2 min. Finalmente, los SynBioNF se obtuvieron mediante centrifugación (2,500×g, 15 min) para recoger los productos sobrenadantes y purificarlos a través de una unidad de filtración (100 nm, Millipore).

Perfilado de citometría de flujo de proteínas de fusión

Las células de levadura con expresión de proteína de fusión (10⁷ células ml^-1) se recogieron y lavaron usando PBS que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 0.1 % (500 µl) mediante centrifugación (1,500×g, 4 min) a 4 °C. Para permitir el marcaje de la proteína de la superficie de la levadura, las células de levadura se incubaron con anticuerpo anti-Myc marcado con DyLight 650 (dilución 1:100) y RBD-mNeonGreen, o proteína anti-dengue NS1 seguido de anticuerpo anti-His marcado con PE (dilución 1:100) en PBS que contiene BSA al 0.1 % (100 l) con rotación y protegido de la luz a 4 °C durante 1 hora. Las células de levadura marcadas se centrifugaron (1,500xg, 4 min) y se lavaron con PBS que contenía BSA al 0.1 % (500 µl), seguido de resuspensión en PBS que contenía BSA al 0.1 % (500 µl) para la prueba. Los controles de células de levadura sin el uso de anticuerpos anti-Myc o anti-His, anti-dengue NS1 y RBD-mNeonGreen se prepararon con el mismo protocolo. Las células de levadura obtenidas se sometieron a perfiles de citometría de flujo (CytoFLEX, Beckman Coulter) utilizando dos láseres (488 y 633 nm) y dos filtros de paso de banda (525/40 y 660/20 nm). Los datos se adquirieron utilizando CytExpert (2.4.0.28) y se analizaron con el software FlowJo (10.8.1).

Cultivo de SCV2 usando línea celular

SCV2 se cultivó en células Vero E6. Las células Vero E6 se cultivaron primero en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 2% inactivado por calor. Cuando las células tenían una confluencia del 70 al 90 %, el inóculo viral se inoculó en las células Vero E6 y se incubó a 37 °C (5 % CO₂); se observó el efecto citopático. SCV2 se cosechó en el sobrenadante mediante centrifugación a 4,500 ×g durante 10 min. El virus se irradió con gamma a una dosis de 50 kGy para inactivarlo.

Cuantificación RT-qPCR de SCV2 cultivado

Para cuantificar el stock SCV2 cultivado, se realizó RT-qPCR. Se utilizó el kit de aislamiento de ARN viral MagMAX-96 para extraer el ARN de SCV2. Los estándares del gen E sintético gBlock se utilizaron para establecer la curva de calibración relacionada con el número de copias. La prueba empleó la mezcla maestra AgPath-ID One-Step RT-PCR con los siguientes cebadores: CoV-E-fwd (5'-AGT ACG AAC TTA TGT ACT CAT TCG TT-3'), CoV-E-R2 (5' '-ATA TTG CAG CAG TAC GCA CAC A-3') y sonda TaqMan (sonda CoV E 5'-6-FAM-ACA CTA GCC ATC CTT ACT GCG CTT CG-MGB-3'). La detección de SCV2 se realizó por duplicado utilizando la media para la calibración en un instrumento de Applied Biosystems. Las condiciones de ciclado fueron 45 °C por 10 min y 95 °C por 10 min, seguidas de 45 ciclos de 95 °C por 15 s y 60 °C por 45 s.

Conjugación de SynBioNFs de detección con nanocajas de aleación de oro y plata

La conjugación de SynBioNF con nanocajas de aleación de oro y plata se realizó a través del autoensamblaje mediado por SpyCatcher-/SpyTag. Las nanocajas de aleación de oro y plata recubiertas con SpyCatcher se prepararon primero de la siguiente manera: las nanocajas de aleación de oro y plata se sintetizaron siguiendo nuestro trabajo anterior³⁰. Se centrifugó un mililitro de nanocajas a 800×g durante 15 min. Luego, se incubaron 10 µl de indicador Raman (MMC) y 2 µl de molécula conectora (MUA) con las nanocajas anteriores durante 5 h. Después de eliminar la MMC y la MUA libres mediante centrifugación a 800×g durante 15 min, 10 µl de hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (10 mM) y 20 µl de N-hidroxisulfosuccinimida (10 mM) para activar el grupo carboxilo en MUA. Luego, se incubaron 0.5 µg de SpyCatcher con las nanocajas durante 30 min a temperatura ambiente. Las nanocajas recubiertas con SpyCatcher se purificaron con centrifugación a 800×g durante 15 min y se resuspendió en 200 µl de BSA al 0.1 %.

A continuación, se incubaron 30 µl de las nanocajas recubiertas con SpyCatcher con 4 µl de SynBioNF (Sb68–SpyTag) (8 µg µl^-1) en 60 µl de tampón PB 10 mM, PBS 1 mM y BSA al 1 % durante 10 min. Los productos finales se recogieron por centrifugación a 600×g durante 10 min y lavado con BSA al 0.1%.

Caracterización NanoFCM de SynBioNFs y nanobox bioconjugados

Las mediciones de NanoFCM se realizaron en un NanoAnalyser de flujo de nanoFCM (NanoFCM). El NanoAnalyser primero se calibró en cuanto a concentración y tamaño utilizando las nanopartículas estándar proporcionadas por la empresa. La distribución de tamaños de los SynBioNF se obtuvo comparándolos con el estándar de tamaño de cóctel (es decir, nanopartículas de sílice premezcladas con diferentes diámetros). Para perfilar el perfil de fluorescencia de los SynBioNF conjugados con nanobox de aleación de oro y plata contra RBD-mNeonGreen, se incubaron 30.0 µl de los conjugados con 0.5 µl de RBD–mNeonGreen (350 µM) a temperatura ambiente durante 30 min y se lavaron los productos tres veces con BSA al 0.1 % mediante centrifugación a 600×g durante 10 min, seguido de la grabación de los eventos durante 1 min. Se utilizó la misma cantidad de nanobox de aleación de oro y plata y SynBioNF sin reaccionar con RBD-mNeonGreen como controles negativos para establecer el umbral.

Detección SERS habilitada para SynBioNF de RBD, SCV2, muestras de pacientes simuladas y muestras clínicas de COVID-19

Los microelectrodos de oro se prepararon internamente mediante un enfoque de fotolitografía con obleas de vidrio de borosilicato de 4 pulgadas y siguiendo un protocolo previamente establecido.³¹. Después de la fotolitografía, la oblea constaba de una matriz de 28 microelectrodos de oro circulares con electrodos de trabajo internos (1.00 mm de diámetro) y contraelectrodo externo (0.12 mm de diámetro). Los electrodos de trabajo y contraelectrodo estaban separados por 1 mm. Para contener la muestra en los microelectrodos de oro, se adjuntó a la oblea una estructura de pozo hecha de polidimetilsiloxano. Antes de la funcionalización, los microelectrodos de oro se lavaron con PBS 1x. Posteriormente, se pipetearon SynBioNF (Sb68–MatterTag) en los microelectrodos de oro y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. El exceso de SynBioNF (Sb68-MatterTag) se eliminó lavando tres veces con 1x PBS. Finalmente, los microelectrodos de oro se bloquearon con BSA al 5 % en PBS 1X durante 1 h a temperatura ambiente. Antes de su uso, los microelectrodos de oro se lavaron con 1x PBS. A continuación, se pipeteó una mezcla de 30 µl de la muestra del paciente (20 µl de muestra + 10 µl de PBS/Tween-1 al 80 %) sobre el microelectrodo de oro y se incubó durante 45 min bajo estimulación de nanomezcla mediante electrohidrodinámica de corriente alterna (frecuencia, 500 Hz; amplitud, 800 mV). En particular, la inclusión de tampón PBS/Tween-1 al 80 % en las muestras de los pacientes tenía como objetivo inactivar el virus. Para muestras clínicas que no son contagiosas después del tratamiento (por ejemplo, radiación gamma), las muestras se pueden aplicar directamente en la plataforma sin el uso de tampón PBS/Tween-1 al 80 %. Posteriormente, después de lavar los microelectrodos de oro con PBS 1x, los bioconjugados de SynBioNFs (Sb68-MatterTag) y las nanocajas se incubaron durante 20 min en las mismas condiciones de nanomezcla que antes. Finalmente, el exceso de bioconjugados se eliminó lavando con PBS 1X. Luego, los microelectrodos de oro se sometieron a un mapeo Raman confocal (espectrómetro WITec alpha300 R) y se recolectaron/analizaron los datos usando el software WITec Suite FIVE. En concreto, se utilizó un láser de He-Ne con una longitud de onda de excitación de 632.8 nm, objetivo ×20, cámara con dispositivo de acoplamiento de carga multiplicador de electrones, tiempo de integración de 0.05 s y tamaño de paso de 1 µm para escanear las imágenes con un tamaño de 60 µm × 60 micras.

Detalles de la muestra clínica

Las muestras de pacientes clínicos SCV2 positivos fueron suministradas por la Unidad de Diagnóstico Molecular de Pathology Queensland y consistieron en hisopos nasofaríngeos resuspendidos en PBS. Estas muestras se analizaron utilizando RT-qPCR de diagnóstico in vitro en la Unidad de Diagnóstico Molecular muy temprano en la pandemia, mientras que los ensayos de diagnóstico aún se estaban validando por completo. Las muestras positivas y negativas fueron proporcionadas por el Laboratorio de Enfermedades Infecciosas, División de Prevención de Microbiología, Patología de Queensland, y analizadas utilizando la plataforma BGI validada. Las muestras de los pacientes se recolectaron bajo la siguiente aprobación ética: HREC ref. No. HREC/2020/QRBW/70461; título del proyecto, optimización del diagnóstico clínico para SCV2. Este comité de ética aprobó una renuncia al consentimiento y no se aplicó compensación para este estudio.

Detección de plataforma fluorescente de SCV2

Se incubaron sesenta microlitros de SynBioNF (Sb68-MatterTag) en la superficie dorada a temperatura ambiente durante 2 h, seguido de un lavado tres veces con PBS para eliminar los SynBioNF libres. Luego, se cargaron 60 µl de la solución de muestra (es decir, SCV2 o medio de control) y se incubaron en el área de detección a temperatura ambiente durante 1 h. Las fichas de oro se lavaron con PBS tres veces para eliminar los objetivos no capturados. A continuación, se aplicaron 50 µl de los bioconjugados sobre los chips y se incubaron durante 1 h. Para preparar los bioconjugados, se incubaron 500 µl de SynBioNF (Nb21–StrepTag) y 10 µl de microesferas fluorescentes (recubiertas con estreptavidina) en un tubo Eppendorf a temperatura ambiente durante 1 hy se purificaron mediante centrifugación. Después de deshacerse de los bioconjugados libres, se tomaron imágenes de los chips de oro bajo un microscopio de fluorescencia. Las imágenes adquiridas luego se analizaron con el software ImageJ (1.53).

Detección electroquímica de SCV2

Se incubaron sesenta microlitros de SynBioNF (Sb68-MatterTag) en los electrodos serigrafiados a temperatura ambiente durante 2 h. Después de lavar los SynBioNF libres (Sb68–MatterTag), se aplicaron 60 µl de la solución de muestra (es decir, SCV2 o control medio) en los electrodos de trabajo circulares internos durante una incubación de 1 h y luego se lavaron tres veces con PBS para análisis electroquímico. detección. Para la medición de DPV, 40 µl de 2.5 mM [Fe(CN)₆]^3-/[Fe(CN)₆]^4- Se añadió un par redox en PBS 1x (pH 7.4) que contenía KCl 0.1 M sobre los electrodos serigrafiados para registrar la corriente. El escaneo DPV se realizó en un analizador electroquímico CHI 650D (CH Instruments) utilizando un voltaje de escaneo de –0.2 a 0.4 V, amplitud de pulso de 50 mV, ancho de pulso de 50 ms, paso de potencial de 5 mV y período de pulso de 10 ms. Las medidas de CV se realizaron en PBS 10 mM en presencia de [Fe(CN)₆]^3-/4- sistema redox (pH 7.4, 2.5 mM [Fe(CN)₆]^3-/4-). Los datos se registraron entre –0.6 y 0.6 V a una velocidad de exploración de 100 mV s^–1.

LFA para detección de SCV2

Se prepararon tiras de prueba de flujo lateral (ancho, 7 mm; largo, 80 mm) utilizando tiras de nitrocelulosa HP-80 FF con respaldo laminado (Cytiva) y almohadillas absorbentes de tamaño mediano unidas en la parte superior de las tiras. Se prepararon tiras múltiples utilizando un cortador de tiras programable de alta velocidad (KinBio). Cada tira se secó con 0.2 µl (200 ng) de anticuerpos monoclonales CR3022 de captura y se secó en una incubadora a 37 °C durante 15 min. Los anticuerpos CR3022 se prepararon internamente usando cultivo de células de ovario de hámster chino.

Las muestras para las tiras de flujo lateral se colocaron en tubos de paredes delgadas de 0.2 ml y se incubaron a 37 °C durante 10 min. A continuación, se mezclaron 10 µl de bioconjugados de SynBioNF (Nb21–SpyTag) y nanopartículas esféricas de oro (recubiertas con SpyCatcher) en PBS con 10 µl de SCV2 o medio de control. Luego, se incluyeron BSA al 1% y Tween-1 al 80% en cada reacción. Cada reacción se incubó a 37 °C durante 15 min. Toda la reacción (20 µl) se dividió en alícuotas en pocillos de una placa de 96 pocillos, y las tiras de prueba se sumergieron en los pocillos para permitir que las muestras se desplazaran verticalmente por las tiras hacia la almohadilla absorbente durante 1–2 min. Luego, se añadieron 50 µl de PBST (1x PBS + Tween-0.05 al 20 %) a los pocillos y se incubaron durante 5 min más para mover todos los bioconjugados hacia arriba en la tira. Se tomaron imágenes de las reacciones colorimétricas visuales en la línea de captura usando una cámara digital.

Ensayo basado en ELISA para prueba de estabilidad y avidez

Para el ensayo ELISA, 10 µg ml^-1 de proteína SCV2 RBD recombinante diluida en TBS 1x (Tris 20 mM (pH 8.0), NaCl 300 mM) se revistió en pocillos de placas MaxiSorp ELISA durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, los pocillos se incubaron con el tampón de bloqueo (BSA al 3.00 % en TBS con Tween-0.05 al 20 %) durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron a cada pocillo 100 µl de SynBioNF RBD anti-SCV2 (Nb21–SpyTag) (1:5) o anticuerpo policlonal de conejo (1:10,000) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Para un análisis de estabilidad térmica, SynBioNFs o alícuotas de anticuerpos policlonales de conejo se incubaron a la temperatura indicada durante 1 h y posteriormente se agregaron a los pocillos respectivos. Para el ensayo de avidez, se añadieron urea, clorhidrato de guanidina, Triton X-100, dodecilsulfato de sodio o NaCl en las concentraciones indicadas durante 1 hora a temperatura ambiente. Para probar las condiciones de pH ácido, se utilizó una mezcla de tampones de ácido cítrico y fosfato de sodio (pH, 2.6–7.6). Para condiciones de pH alcalino, se utilizó una mezcla de tampones de carbonato de sodio y bicarbonato de sodio (pH, 9.2–10.8). Después de lavar los pocillos con TBST cinco veces, se añadió a los pocillos anticuerpo anti-Myc tag conjugado con HRP (dilución 1:5,000 en BSA al 3 %-TBST) o anticuerpo secundario IgG de cabra anticonejo conjugado con HRP (1:10,000 1). durante 100 h. Los pocillos se lavaron con TBST y finalmente se añadieron 100 µl de sustrato TMB a cada pocillo y la reacción se detuvo con 1 µl de ácido sulfúrico XNUMX M.

Ensayo de octeto para medir la interacción de proteínas

Se pretrataron sensores de estreptavidina (ForteBio) en 200 µl de PBS 10 mM durante 10 min. Cada pocillo se cargó con 200 µl de la solución. El ensayo se realizó configurando un programa: los sensores se sumergieron en PBS durante 120 s en el paso de referencia inicial, se cargaron con 75 µg de estreptococos RBD por pocillo en la muestra de carga, se sumergieron en PBS durante 120 s en el segundo paso de referencia, interactuó con SynBioNFs (Nb21–SpyTag) o nanocuerpo Nb21 soluble durante 300 s en el paso de asociación y terminó con disociación en PBS durante 600 s.

análisis estadístico

La sensibilidad, la especificidad y la precisión diagnósticas del cribado de muestras clínicas basado en SynBioNF en la plataforma SERS se determinaron en función de la matriz de confusión (Fig. 6c) con las siguientes fórmulas:

Sensibilidad = Número de evaluaciones positivas verdaderas / Número de todas las evaluaciones positivas = 81/(81 + 3) = 96.43 %;

Especificidad = Número de evaluaciones negativas verdaderas / Número de todas las evaluaciones negativas = 50/(0 + 50) = 100 %;

Precisión = Número de evaluaciones correctas / Número de todas las evaluaciones = (81 + 50)/(81 + 3 + 0 + 50) = 97.76 %.

Dos colas t-Las pruebas, la curva característica operativa del receptor y el análisis de Bland-Altman se realizaron en GraphPad Prism (v. 9.2).

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de la cartera de naturaleza vinculado a este artículo.

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01415-1