Empresas proveedoras de equipos, reactivos y/o insumos: Abcam, Cambridge, MA; Laboratorios ACD, Toronto, CA; Acris Antibodies, Inc), San Diego, CA; Recursos Avanzados de Biociencia, Inc (ABR), Rockville, MD; Agilent Technologies, Santa Clara, CA; Alpco Diagnostics, Salem, Nueva Hampshire; Biosistemas Aplicados, Foster City, CA; BD Pharmingen, San José, CA; Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey; Laboratorios Bethyl, Montgomery, TX; BioAssay Systems, Hayward, CA; Laboratorios de Isótopos de Cambridge, Tewksbury, MA; Biotime, Inc., Alameda, CA; Microscopía Carl Zeiss, Thornwood, Nueva York; Carolina Liquid Chemistries, Corp., Winston-Salem, NC; Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MA; Chenomx, Inc., Alberta, Canadá; Cole-Parmer, Court Vernon Hills, IL; DiaPharma, Municipio de West Chester, OH; Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania; Gatán, Inc., Pleasanton, CA; Illumina, San Diego, CA; Ingenio, Redwood City, CA; Life Technologies Corp., Grand Island, Nueva York; Leica, Washington, DC; LifeSpan Biosciences, Inc., Seattle, A; Dispositivos Moleculares, Sunnyvale, CA; Olympus Scientific Solutions Americas Corp., Waltham, MA; PhoenixSongs Biologicals (PSB), Branford, CT; Polysciences, Inc., Warrington, Pensilvania; Qiagen, Germantown, MD; Sistemas de Investigación y Desarrollo, Minneapolis, MN; RayBiotech, Norcross, GA; Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania; Santa Cruz Biotechnology, Inc), Dallas, TX; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; Sofregen, Medford, MA; Takara, Otsu, Japón; Tousimis Research Corp., Rockville, MD; Triangle Research Labs (TRL), Research Triangle Park, Carolina del Norte; Umetrics, Umea, Suecia; Varian Medical Systems, Inc), Palo Alto, CA; Laboratorios de vectores, Burlingame, CA; VWR Scientific, Radnor, Pensilvania.

Las declaraciones éticas resumen cómo se mantuvo a los animales. Todos los experimentos con animales se realizaron en estricta conformidad con los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales aprobados de la Universidad Estatal de Carolina del Norte (NCSU) en Raleigh y en la Universidad de Carolina del Norte (UNC) en Chapel Hill y, por lo tanto, han seguido los principios descritos en la Declaración. de Helsinki para todas las investigaciones experimentales con humanos o animales. Todos los procedimientos utilizados en estudios con animales y aquellos que implican el uso de tejidos humanos fueron aprobados por los comités del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y la Junta de Revisión Institucional (IRB) en ambas instituciones: la UNC y la Facultad de Medicina Veterinaria de NCSU. . Los números de aprobación de IACUC son 16-316.0 y 17-225.0. Los estudios de células humanas en este proyecto fueron evaluados por el comité del IRB y recibieron un número de aprobación del IRB de 97-1063.

Las muestras humanas incluyen información de cada muestra más información general de todas las muestras y detallada en estudios previos:^39,41,42

El tejido hepático fetal fue proporcionado por una agencia acreditada (Recursos Biológicos Avanzados, San Francisco, CA) de fetos entre 18 y 22 semanas de edad gestacional obtenidos por interrupciones electivas del embarazo. El protocolo de investigación fue revisado y aprobado por el IRB para Estudios de Investigación en Humanos de la UNC. Todas las muestras se examinaron en busca de varios patógenos y solo aquellas libres de estos fueron aceptadas para los estudios de investigación.

Los hígados posnatales se obtuvieron de donantes cadavéricos neonatales, pediátricos y adultos y se obtuvieron a través de programas de donación de órganos a través de UNOS. Los que se usaron para estos estudios se consideraron normales sin evidencia de procesos patológicos, incluido el seguimiento de la detección de patógenos. Se obtuvo el consentimiento informado de los familiares más cercanos para el uso de los hígados con fines de investigación, los protocolos recibieron la aprobación del IRB y el procesamiento cumplió con las Buenas Prácticas de Manufactura.

Las muestras de cerdos procedían de animales mantenidos en las instalaciones de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Estatal de Carolina del Norte (NCSU, Raleigh, NC). Algunos de ellos fueron utilizados como anfitriones o como donantes de células. En estas instalaciones se realizaron cirugías, necropsias y la recolección de todos los fluidos y tejidos biológicos.

Los huéspedes porcinos utilizados para los injertos eran una mezcla de seis razas diferentes: un cruce de seis vías que constaba de Yorkshires, Large Whites, Landraces (de las cerdas), Durocs, Spots y Pietrans (de los verracos). Este trasfondo genético altamente heterogéneo es deseable porque es paralelo a las constituciones genéticas heterogéneas de las poblaciones humanas.⁶⁵. Los animales huéspedes eran todas hembras, ~6 semanas de edad y ~15 kg.

Proteína verde fluorescente (GFP)⁺ Se establecieron donantes de cerdos transgénicos que portaban un transgén de histona-eGFP H2B. La GFP⁺ los animales donantes se obtuvieron cruzando un verraco transgénico H2B-GFP con una primeriza de tipo salvaje mediante inseminación artificial estándar⁶⁶. El modelo se desarrolló a través de la reparación dirigida por homología (HDR) mediada por CRISPR-Cas9 de IRES-pH2B-eGFP en el locus endógeno de β-actina (ACTB). Los animales transgénicos muestran una expresión ubicua de pH2B-eGFP en todos los tejidos. La fusión de GFP a H2B da como resultado la localización del marcador GFP en el nucleosoma y permite una visualización nuclear clara, así como el estudio de la dinámica cromosómica. La línea fundadora se ha analizado extensa y ubicuamente, y se ha confirmado la expresión localizada en el núcleo. Además, la reproducción ha demostrado la transmisión de H2B-GFP a la próxima generación. Todos los animales estaban sanos y se establecieron embarazos múltiples con progenie que mostraba la relación mendeliana esperada para la transmisión de pH2B-eGFP. La descendencia masculina se genotipificó al nacer, y aquellos que dieron positivo para el transgén se sacrificaron de forma humanitaria para la recolección de tejido y el aislamiento de las células del donante.

Se realizó el genotipado de animales porcinos. Para cada animal donante y receptor, los loci del antígeno leucocitario porcino de clase I (SLA-I) y clase II (SLA-II) se han amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores diseñados para amplificar los alelos conocidos en estas regiones en función de la PCR. -estrategia de cebador específico de secuencia¹⁸. El sistema consta de 47 conjuntos de cebadores SLA-I discriminatorios que amplifican los loci SLA-1, SLA-2 y SLA-3, y 47 conjuntos de cebadores SLA-II discriminatorios que amplifican los loci DRB1, DQB1 y DQA.⁶⁷. Estos conjuntos de cebadores se han desarrollado para diferenciar alelos por grupos que comparten motivos de secuencia similares y se ha demostrado que detectan fácilmente y sin ambigüedades los alelos SLA-I y SLA-II conocidos. Cuando se usaron juntos, estos conjuntos de cebadores proporcionaron efectivamente un haplotipo para cada animal que se probó, proporcionando así un ensayo para confirmar fácilmente un haplotipo coincidente o no coincidente en animales donantes y receptores.

Las cirugías en los cerdos se realizaron con anestesia inducida mediante la administración de una combinación de ketamina/xilazina (2-3 mg/kg de peso cada una) inyectada IV o 20 mg/kg de ketamina más 2 g/kg de xilazina IM, y se mantuvieron con isoflurano en oxígeno. administrado a través de una unidad de anestesia de gas de circuito cerrado. En los injertos en el hígado y los procedimientos quirúrgicos generales, los cerdos se colocaron en decúbito dorsal y se cortó el abdomen ventral desde el xifoides hasta el pubis. La piel se preparó asépticamente alternando exfoliantes yodados y soluciones alcohólicas. Después de la entrada en la sala de cirugía, la preparación de la piel se repitió con una técnica estéril y el área se cubrió con una solución tópica de yodo antes de la aplicación de paños quirúrgicos estériles. Los cirujanos utilizaron una técnica aséptica adecuada. Se hizo una incisión ventral media a través de la piel, a través de los tejidos subcutáneos y línea alba, comenzando en el proceso xifoides y extendiéndose caudalmente de 8 a 12 cm. Se expuso la división hepática izquierda y se aplicó un injerto de parche de 3 × 4.5 cm en la superficie ventral del hígado que contenía un hidrogel de hialuronano 1X (~60 Pa) con organoides BTSC incrustados y se colocó sobre el respaldo que contenía hidrogel de hialuronano 10X (~ 760 Pa); el parche se colocó en contacto directo sobre la superficie de la cápsula hepática. El injerto de parche se suturó al hígado con 4-6 puntos simples interrumpidos de polipropileno 4-0. Luego, la superficie expuesta del injerto se trató con 2 ml de hidrogel de hialuronano 2X (~200–300 Pa), un nivel de rigidez lo suficientemente fluido como para permitir que se pintara o recubriera el exterior del injerto; sirvió además para minimizar las adherencias de los tejidos vecinos. Después de la colocación del injerto quirúrgico, el línea alba se cerró con una sutura continua simple utilizando 0-PDS. El linea se bloqueó con 2 mg/kg de bupivacaína al 0.5%, IM. Los tejidos subcutáneos y la piel se cerraron con suturas continuas 2-0 PDS y 3-0 Monocryl, respectivamente. Se colocó adhesivo tisular sobre la superficie de la piel.

Para los injertos en el páncreas, los procedimientos quirúrgicos para cerdos utilizaron un injerto que puede ser de cualquier tamaño que se adapte a las dimensiones del páncreas. Para la exposición del páncreas, se colocaron suturas permanentes en el duodeno descendente. El injerto se colocó en la cabeza del páncreas y adyacente al duodeno con el hidrogel de hialuronano suave (~60 Pa) que contenía los organoides en contacto directo con el páncreas, y con el hidrogel de hialuronano más rígido (~760 Pa) dentro de la seda. apoyo. Utilizamos suturas en las cuatro esquinas (4-0 Prolene); las dos primeras suturas de las esquinas se colocaron en el duodeno descendente; los otros 2 se colocaron en el mesenterio y evitando el parénquima pancreático (para minimizar cualquier propensión a la autólisis por parte del páncreas). Luego, la superficie serosa del injerto se cubrió con hidrogel de hialuronano 2X (~200–300 Pa) para minimizar las adherencias. El abdomen se cerró con sutura absorbible continua (PDS) en las capas lineal, subcutánea y subcuticular. Se usó adhesivo tisular sobre la piel para evitar suturas cutáneas.

Se requirió inmunosupresión ya que los trasplantes de los cerdos transgénicos a los receptores de tipo salvaje eran alogénicos. Los protocolos de inmunosupresión utilizados fueron los establecidos por otros^68,69. Todos los cerdos recibieron dosis orales de fármacos inmunosupresores, Tacrolimus (0.5 mg/kg) y Micofenolato (500 mg) dos veces al día, comenzando 24 horas antes de la cirugía. Los fármacos se administraron de forma continua durante todo el período experimental. Estos podrían administrarse fácilmente a los animales si se mezclan con sus comidas favoritas.

El aislamiento de tejidos normales se realizó a partir de lechones recién nacidos y de cerdos mayores de 12 semanas. Los lechones recién nacidos pesaban ~10 libras; los cerdos mayores, de 12 semanas de edad, pesaban entre 50 y 60 lbs. Los cerdos se sacrificaron mediante eutanasia con perno cautivo penetrante seguida de exanguinación yugular. El método cumple con las pautas recomendadas por la Asociación Médica Veterinaria Estadounidense para la eutanasia en cerdos.⁶⁵. En la Tabla complementaria se proporciona una lista de donantes utilizados para tejidos biliares de lechones o cerdos adultos. 4.

Todos los medios se esterilizaron por filtración (filtro de 0.22 µm) y se mantuvieron en la oscuridad a 4 °C antes de su uso. El medio basal y el suero bovino fetal (FBS) se adquirieron de GIBCO/Invitrogen. Todos los factores de crecimiento se adquirieron de R&D Systems. Todos los demás reactivos, excepto los indicados, se obtuvieron de Sigma.

Los tampones de lavado de células constaban de 500 ml de medio basal (p. ej., RPMI 1640; Gibco n.º 11875-093) complementados con 0.5 g de albúmina sérica (Sigma, n.º A8896-5G, libre de ácidos grasos), 10^-9 M selenio y 5 ml de antibióticos (Gibco #35240-062, AAS). Se utilizó para lavar tejidos y células durante el procesamiento.

El tampón de colagenasa consistió en 100 ml de lavado celular suplementado con colagenasa (Sigma # C5138) con una concentración final de 600 U/ml (R1451 25 mg) para tejido del árbol biliar (conductos) y 300 U/ml (12.5 mg) para órganos ( ej., hígado).

Medio de Kubota, un medio sin suero completamente definido diseñado originalmente para hepatoblastos⁷⁰, y luego resultó exitoso para el mantenimiento de células madre del árbol biliar, células madre hepáticas y células madre pancreáticas y progenitores (y luego resultó exitoso en general para todos los tallos/progenitores endodérmicos evaluados), se usó para preparar suspensiones celulares, organoides y hidrogeles de hialuronano. Este medio consta de cualquier medio basal (aquí RPMI 1640) sin cobre, bajo en calcio (0.3 mM), selenio 1 nM, albúmina sérica al 0.1% (purificada, libre de ácidos grasos; fracción V), nicotinamida 4.5 mM, nicotinamida 0.1 sulfato de zinc heptahidratado nM, transferrina/Fe 5 µg/ml, insulina 5 µg/ml, lipoproteína de alta densidad 10 µg/ml y una mezcla de ácidos grasos libres purificados que se presentan complejados con albúmina libre de ácidos grasos altamente purificada . La mezcla de ácidos grasos libres estaba compuesta por ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico. El medio de Kubota está disponible comercialmente en PhoenixSongs Biológicos (Branford, Connecticut).

Los hialuronanos (HA) usados ​​incluyeron las formas solubles de cadena larga de HA (Catálogo Sigma #52747) y se usaron en la estabilización de cultivos de organoides y en la crioconservación de suspensiones celulares.^71,72. Los que se usaron para fabricar los hidrogeles, HA modificados con tiol, se obtuvieron de Glycosan Biosciences, anteriormente una subsidiaria de Lineage Cell Therapeutics (Alameda, CA), y ahora se ofrecen en forma de grado no clínico de Advanced Biomatrix (Carlsbad, CA) y en el formulario de grado clínico de Sentrex Animal Care (Salt Lake City, UT) (G. Prestwich, comunicaciones personales). Los componentes de estos HA modificados con tiol se fabricaron mediante un proceso patentado de fermentación bacteriana utilizando Bacillus subtilis como anfitrión en un proceso ISO 9001:2000 (www.biopolímero.novozymes.com/). Los componentes fueron producidos por Novozymes bajo el nombre comercial HyaCare® y están 100% libres de materiales derivados de animales y solventes orgánicos residuales. No se utilizan ingredientes derivados de animales en la producción; hay niveles de proteína muy bajos y no hay endotoxinas. La producción sigue los estándares establecidos por la Farmacopea Europea. Los hidrogeles de HA se prepararon utilizando Glycosil (HyStem® HA, ESI BIO-CG313), los HA modificados con tiol que pueden activarse para formar puentes disulfuro en presencia de oxígeno, o mediante la formación de enlaces tio-éter utilizando diacrilato de polietilenglicol (PEGDA ). Glycosil® se reconstituye como una solución al 1 % de HA tiolado en solución salina tamponada con fosfato (PBS) al 1 % utilizando agua desgasificada o, en nuestro caso, en medio de Kubota sin suero. Una vez reconstituido, permanece líquido durante varias horas, pero puede gelificarse si se expone al oxígeno. Se produce una gelificación más precisa sin cambios de temperatura o pH si Glycosil se trata con un reticulante como PEGDA, lo que hace que la gelificación se produzca en unos pocos minutos.^73,74,75,76.

El nivel de entrecruzamiento es el principal contribuyente al nivel de rigidez (viscoelasticidad) o rigidez y se puede controlar ajustando la proporción de hialuronanos modificados con tiol a PEGDA⁷⁶. En estudios anteriores, las poblaciones de células madre hepáticas se analizaron en hidrogeles de HA de diversos niveles de rigidez y se encontró que permanecían como células madre, tanto antigénica como funcionalmente (p. ej., con respecto a la capacidad de migrar y a la expresión de genes asociados a células madre). como genes de pluripotencia y metaloproteinasas de matriz), solo si el nivel de rigidez era inferior a ~100 Pa⁷⁶. Utilizamos este hallazgo para diseñar injertos con una capa blanda (~100 Pa o menos) en la que incrustar organoides de BTSC y con capas más rígidas (~700 Pa) de hidrogeles de hialuronano en el respaldo para formar una barrera contra la migración en direcciones distintas. que el tejido objetivo, así como aquellos con niveles intermedios de rigidez (~200–300 Pa) para minimizar las adherencias.

Las propiedades reológicas a macroescala de los hidrogeles de hialuronano se determinaron utilizando un reómetro de cono y placa controlado por tensión (TA Instruments, AR-G2, cono de 40 mm de diámetro, ángulo de 1°). Los geles se polimerizaron activamente en el reómetro mientras oscilaban a una frecuencia de 1 rad/sy una amplitud de tensión de 0.6 Pa con el módulo monitorizado continuamente para consultar si las reacciones de reticulación se completaban lo suficiente. Una vez equilibrados, los hidrogeles se sometieron a un barrido de frecuencia oscilatorio (amplitud de tensión: 0.6 Pa, rango de frecuencia: 0.01–100 Hz).

La preparación de células se realizó a partir de tejido del árbol biliar extrahepático (vesícula biliar, conducto común, conductos hepáticos) obtenido de cerdos [o de tejido humano]. Para los tejidos utilizados para generar organoides de células normales, los tejidos se golpearon con un mazo de acero inoxidable esterilizado para eliminar las células parenquimatosas, manteniendo cuidadosamente la unión de los conductos biliares intrahepáticos y extrahepáticos. A continuación, se lavó el árbol biliar con el tampón de "lavado de células" compuesto por un medio basal estéril sin suero suplementado con antibióticos, albúmina sérica al 0.1 % y selenio 1 nM (10^-9 METRO). Luego se disoció mecánicamente con bisturíes cruzados y los agregados se dispersaron enzimáticamente en una suspensión celular en RPMI-1640 suplementado con albúmina de suero bovino (BSA) al 0.1 % [o para tejidos humanos, albúmina de suero humano, HAS], selenio 1 nM, 300 U/ml de colagenasa tipo IV, 0.3 mg/ml de desoxirribonucleasa (ADNasa) y antibióticos. La digestión se realizó a 32 °C con agitación frecuente durante 30 a 60 min. La mayoría de los tejidos requirieron dos rondas de digestiones seguidas de centrifugación a 1100 rpm a 4 °C. Los sedimentos celulares se combinaron y se resuspendieron en un lavado celular. La suspensión celular se centrifugó a 30xg durante 5 min a 4 ° C para eliminar los glóbulos rojos. Los sedimentos de células se volvieron a suspender en lavado de células y se filtraron a través de un filtro de células de nailon de 40 µm (Becton Dickenson Falcon #352340) con lavado de células fresco. Se determinaron los números de células y se evaluó la viabilidad utilizando Trypan Blue. Se observó rutinariamente una viabilidad celular superior al 90-95 %.

La formación de organoides se realizó a partir de suspensiones celulares añadidas a placas de cultivo celular de fondo plano y multipocillos (Corning #353043) en medio de Kubota sin suero y se incubó durante ~ una hora a 37 °C para facilitar la unión de células mesenquimatosas maduras (por ejemplo, estroma maduro). , células estrelladas maduras). Células mesenquimales maduras adheridas a los platos en ~ 15 min, aunque el medio no tenía suero. Las células inmaduras permanecieron en suspensión y se transfirieron a otra placa y se incubaron nuevamente hasta por una hora. Esto se repitió varias veces para asegurar el agotamiento de una fracción significativa de las células mesenquimatosas maduras. Después del agotamiento de las células mesenquimatosas maduras, las células flotantes restantes se sembraron a ~2 × 10⁵ células por pocillo en medio de Kubota sin suero en placas de fijación ultrabaja de Corning (Corning n.º 3471) y se incubaron durante la noche a 37 °C en un CO₂ incubadora. Los organoides compuestos por células madre del árbol biliar (BTSC) se asociaron con células mesenquimales en etapa de linaje temprano (ELMSC) formadas durante la noche. Se encontró que las ELMSC por su expresión de antígenos de superficie específicos eran angioblastos (CD117⁺, CD31^-, VEGFr⁺) y precursores de endotelios (CD31⁺, VEGFr⁺) y a las células estrelladas (ICAM-1⁺, CD146⁺). Se realizaron caracterizaciones más extensas de estos ELSMC y los hallazgos se publicaron anteriormente.^77,78. Los cultivos de organoides sobrevivieron durante semanas en medio de Kubota, especialmente si el medio estaba suplementado (0.1%) con formas solubles de hialuronanos (Sigma).

Las células también podrían criopreservarse como se describe a continuación. De cada gramo de tejido del árbol biliar de cerdo, obtuvimos ~1.5 × 10⁷ células. Usamos ~3–6 × 10⁵ células por pocillo de una placa de fijación ultrabaja de 6 pocillos y se incubaron en medio de Kubota sin suero. Las células produjeron, en promedio, de 6000 a 20,000 50 organoides pequeños (~ 100 a 100,000 células/organoide/pozo). Para los injertos utilizamos al menos 10 organoides (>XNUMX⁷ células). Dependiendo del tamaño del soporte, pudimos aumentar el número de organoides en los injertos hasta >10⁸ organoides (es decir, ~ 10⁹ total de células) o más incrustadas en ~1 ml del hidrogel de hialuronano suave en un respaldo de 3 cm × 4.5 cm.

La crioconservación de tallo/progenitores se realizó con mayor éxito mediante la crioconservación de células aisladas o pequeños agregados de células que se habían sometido a los procedimientos de cribado para minimizar el número de células mesenquimatosas maduras. Se puede crioconservar la mezcla de células madre/progenitoras y células mesenquimales en etapa de linaje temprano en Cryostor10, un tampón de crioconservación isotónico que contiene factores anticongelantes, dextrano y DMSO (Bioliife, Seattle, WA). La viabilidad de las células se mejoró aún más con la suplementación con 0.1 % de HA (Sigma n.º 52747)^71,72. La mayor viabilidad de los organoides fue cuando se prepararon a partir de suspensiones de células criopreservadas recién descongeladas; se observaron viabilidades más bajas con organoides completamente formados y crioconservados. La crioconservación se realizó utilizando congeladores de velocidad controlada CryoMed™. La viabilidad al descongelar fue superior al 90 % para aquellos criopreservados como suspensión celular y luego, al descongelarse, se utilizaron para formar organoides.^71,72.

Los injertos de parche son métodos novedosos establecidos rápidamente para trasplantar grandes cantidades (p. ej., >10⁸th) de organoides en órganos sólidos y que los organoides se integren completamente dentro de los órganos dentro de una semana y maduren en células adultas dentro de otra semana. En nuestras publicaciones anteriores se proporcionan más detalles sobre la lógica, las estrategias y los métodos para el injerto en parche de organoides en órganos sólidos.^54,55. Los injertos se formaron utilizando un respaldo, Contour Seri-silk (Sofregen, Medford, MA), sobre el cual se colocaron los organoides de tallo/progenitores incrustados en hidrogeles de hialuronano suave (~ 50–100 Pa). Estos se prepararon fácilmente con anticipación y se mantuvieron en una placa de cultivo en una incubadora durante la noche. La falta de éxito con los intentos de crioconservar organoides dentro de hidrogeles blandos significó que la incrustación de los organoides en el hidrogel blando tuvo que hacerse justo antes de la cirugía para unir los injertos.

Actualizar: Nos enteramos de que Contour Seri-silk ya no está disponible del fabricante. Los materiales de matriz a base de amnios, como los de Vivex Biologics (Miami, FL), deben proporcionar un sustituto adecuado y es un material de implante aprobado por la FDA para fines clínicos o no clínicos. Estos deben proporcionar un soporte mecánico adecuado para los injertos y se supone que tienen efectos razonablemente neutrales en los organoides donantes; esto es importante para garantizar que los organoides conserven sus características de células madre, lo que les permite expresar metaloproteinasas de matriz (MMP) necesarias para el injerto y la migración⁵⁴. Los usos clínicos de tales matrices derivadas del amnios han sido discutidos por otros en una revisión reciente.⁷⁹. Se supone que no se requerirá el hidrogel de hialuronano más rígido (~700 Pa) dada la compleja química de la matriz dentro del amnios que debería servir como barrera. Sin embargo, se plantea la hipótesis de que después de fijarse al sitio de destino, una barrera de matriz de amnios aún podría requerir un recubrimiento con hialuronanos en ambos lados y con el hialuronano preparado con Medio de Kubota sin suero y en un nivel intermedio de rigidez (~200–300 Pa ). El recubrimiento del lado de la serosa en el momento de la cirugía debe minimizar las adherencias a los tejidos vecinos.

Para los procedimientos de necropsia, todos los animales fueron sacrificados humanitariamente en el momento designado mediante sedación con ketamina/xilazina y anestesia con isofluorano, seguida de una inyección intravenosa de una dosis letal de pentobarbital sódico. Tras la confirmación de la muerte, el cadáver se diseccionó cuidadosamente, se extrajeron los órganos diana y se colocaron en el Medio de Kubota refrigerado para su transporte al laboratorio. Además del hígado, se recogieron los pulmones, el corazón, el riñón y el bazo y se fijaron en formalina neutra al 10%.

La histología se realizó en porciones de los tejidos recién disecados de los cerdos o los injertos en el hígado o el páncreas se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4% y luego se incluyeron en parafina. Se cortaron secciones de cinco micras y se tiñeron con hematoxilina-eosina para análisis histológicos de rutina. Los tejidos obtenidos de cerdos recién nacidos también se prepararon como muestras (hígado, páncreas, árbol biliar y duodeno) en grandes bloques de parafina para facilitar los análisis de las conexiones a lo largo del árbol biliar y el sistema de conductos pancreáticos.

Se utilizó inmunohistoquímica (IHC) para los análisis de varios marcadores y características. Para la tinción inmunofluorescente, se fijaron secciones congeladas de 5 µm o células cultivadas con paraformaldehído (PFA) al 4 % durante 20 min a temperatura ambiente, se enjuagaron con PBS, se bloquearon con suero de cabra al 10 % en PBS durante 2 h y se enjuagaron. Las células fijadas se incubaron con anticuerpos primarios a 4 °C durante 14 h, se lavaron, se incubaron durante 1 h con anticuerpos secundarios específicos de isotipo marcados, se lavaron y se contrastaron con 4´,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la visualización de núcleos celulares y vistos usando un microscopio invertido Leica DMIRB (Leica, Houston, TX) o un Zeiss ApoTome Axiovert 200 M (Carl Zeiss Inc, Thornwood, NY).

Para la IHC, los tejidos se fijaron en PFA al 4 % durante la noche y se almacenaron en etanol al 70 %. Se embebieron en parafina y se cortaron en secciones de 5 μm. Después de la desparafinación, la recuperación del antígeno se realizó con tampón de citrato de sodio (pH 6.0) o tampón de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (pH 8.0) en un vaporizador durante 20 min. Las peroxidasas endógenas se bloquearon mediante incubación durante 15 min en 3% H₂O₂. Las secciones se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con kits de tinción con peroxidasa ImmPRESS y sustratos de 3,3'-diaminobencidina (Vector Laboratories). Las secciones se contrastaron con hematoxilina. Los anticuerpos utilizados se enumeran en la Tabla complementaria 1.

La purificación de poblaciones celulares para estudios genéticos fue importante para varios análisis. La pureza de las subpoblaciones que se aislaron fue dictada por una combinación de estrategias para el aislamiento de las células. Los hepatocitos adultos se aislaron recientemente de hígados porcinos neonatales frente a hígados humanos neonatales, pediátricos y adultos mediante digestión con colagenasa estándar y fraccionamiento con percoll.⁸⁰. Las fracciones de hepatocitos adultos aislados (aquellos con diámetros promedio superiores a 17 µm) se enjuagaron en RPMI1640 suplementado con suero al 2% para inactivar las enzimas utilizadas en el aislamiento de las células; luego se trató con varias rondas de enjuague con medio RPMI 1640 sin suero; y, por último, se congela rápidamente con nitrógeno líquido. Las células no se cultivaron.

Las subpoblaciones de madres/progenitores, tanto humanas como porcinas, se prepararon a partir de células recién aisladas del árbol biliar fetal o neonatal (células madre del árbol biliar), de hígados fetales o neonatales (células madre hepáticas y hepatoblastos), o fetales o neonatales. páncreas (células madre pancreáticas y progenitores ductales); purificado por una combinación de inmunoselección para antígenos de superficie, lo que permite el aislamiento de subpoblaciones celulares separadas^39,41,50,54. Tabla Suplementaria 5 resume los marcadores de las subpoblaciones que se han caracterizado ampliamente, especialmente en estudios anteriores^{31,32,33,38,39,40,41,42,43,49,50}.

Las células inmunoseleccionadas se suspendieron en medio de Kubota sin suero.⁸¹, diseñado para células madre endodérmicas y sembrado en placas de cultivo de baja adherencia durante 6 a 12 h, lo que permite la formación de organoides. Los organoides que se formaron en esas 6 a 12 h comprendían las células madre endodérmicas asociadas con células mesenquimatosas en etapa de linaje temprano: angioblastos y precursores de células endoteliales y estrelladas (nota: las células mesenquimatosas maduras se minimizaron por el proceso de inmunoselección como lo indica el agotamiento de células para antígenos de superficie para las células hematopoyéticas y mesenquimatosas maduras).

La secuenciación de ARN y el análisis de expresión génica incluyeron ARN purificado con el kit Qiagen RNeasy de hígado, páncreas, vesícula biliar y tejido del árbol biliar porcinos (o humanos) adultos y de suspensiones de células aisladas de hepatocitos (AHeps), células madre hepáticas (HpSC), células madre del árbol biliar (BTSC), cada una de tres donantes diferentes para células humanas y cinco donantes diferentes para células de cerdo (Tablas complementarias 6 y 7). La recopilación de datos de RNA-seq y los análisis de control de calidad se representaron específicamente en nuestro estudio anterior⁵². La tubería LIMMA (versión 3.50.1) se utilizó para identificar genes expresados ​​​​diferencialmente (DEG). Los perfiles de expresión génica se compararon utilizando los análisis de correlación de Pearson y Spearman. El análisis de componentes principales (PCA) y el agrupamiento jerárquico se realizaron en R (R versión 4.1.0).

La transcripción inversa cuantitativa y la reacción en cadena de la polimerasa se realizaron utilizando el ARN total de las células. El ARN total se extrajo de las células utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). El ADNc de primera cadena sintetizado usando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena Prime script (Takara, Otsu, Japón) se usó como molde para la amplificación por PCR. Los análisis cuantitativos de los niveles de ARNm se realizaron utilizando Faststart Universal Probe Master (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) con el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 1HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cebadores se diseñaron con el Universal Probe Library Assay Design Center (Roche Applied Science). Las secuencias de cebadores se enumeran en la tabla complementaria 4a. Los primers fueron recocidos a 50 °C por 2 min y 95 °C por 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C (15 s) y 60 °C (1 min). La expresión de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se usó generalmente como estándar.

análisis estadístico

Las diferencias estadísticamente significativas entre las muestras se calculan mediante el método de Student de 2 colas. t-la prueba y los resultados se presentan como la media ± SD. P valores de <0.05 se consideraron estadísticamente significativos.

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de la cartera de naturaleza vinculado a este artículo.

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41536-023-00303-5