Ética

Todos los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Nacional de Chonnam según el protocolo CNU IACUC-H-2021-51. El mantenimiento de las instalaciones de investigación animal y los procedimientos experimentales se llevaron a cabo en rigurosa conformidad con las directrices de la Ley de Bienestar Animal legislada por el Ministerio de Agricultura, Alimentación y Asuntos Rurales de Corea.

Construcción de plásmidos

La construcción y producción de FlaB a partir del sistema de expresión procariota (pFlaB) se describieron previamente [16]. Brevemente, el Vibrio vulnificus flagelina B (FlaB) se clonó en el vector pTYB12. Luego, el plásmido de expresión resultante se transformó en E. coli ER2566 (New England Biolabs, Beverly, MA) mediante electroporación. Las bacterias se esparcieron sobre la placa LB que contenía el antibiótico ampicilina. Luego, cultivamos las bacterias y agregamos el inductor IPTG 0.5 mM (isopropil-β-D-tiogalactopiranósido) a 0.6–0.8 OD600 de cultivo en 20 °C durante 18–20 h. A continuación, sedimentamos las bacterias y las resuspendimos en un tampón de lisis (Tris-Cl 20 mM [pH 7.5], NaCl 500 mM, EDTA 1 mM [pH 8.0], Triton X-0.1 al 100%, Tween 0.1 al 20%, 20 M). fluoruro de fenilmetilsulfonilo) y sonicados (Vibra Cell VCX500; Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT) sobre un lecho de hielo. Después de la centrifugación a 35,000 × g durante 30 minutos, el sobrenadante se mezcló con una perla de resina de quitina y se eliminó la proteína no específica dejándola caer lentamente a 4 °C hasta terminar el volumen y se lavó con tampón de lavado (Tris-Cl 20 mM [pH 7.5], NaCl 500 mM, EDTA 1 mM). [pH 8.0]). Finalmente, la proteína se eluyó con el tampón de elución (Tris-Cl 20 mM [pH 7.5], NaCl 500 mM, EDTA 1 mM [pH 8.0], 50-ditiotreitol 1,4 mM) y se confirmó la pureza de pFlaB mediante SDS- PÁGINA. Para la expresión eucariota FlaB (eFlaB), un codón optimizado FlaB La secuencia del gen fue sintetizada por Bioneer Inc., Corea del Sur. El FlaB El gen se amplificó mediante reacción de PCR utilizando un cebador directo, 5'-CCC.AAGCTTGCCGTCAACGTGAACACCAA-3' que contiene HindIII (AAGCTT) sitio y cebador inverso, 5'-ATAGTTTAGCGGCCGCGCCCAGCAGGGGAGAGGGCGC-3' que contiene yo no (GCGGCCGC) sitio. el amplificado FlaB y el vector de expresión eucariótico pSectag2B (Invitrogen, V900-20) se digirieron mediante enzimas de restricción. HindIII y yo no a 37°C durante la noche. Luego, ligamos el FlaB con el vector pSectag2B mediante ADN ligasa T4 (enzynomics, M001S) a temperatura ambiente durante 2 h. El plásmido ligado se transformó en Escherichia coli TOP10 células competentes y se extienden en una placa de agar LB que contiene ampicilina (Tabla complementaria 1). La secuencia fue confirmada por el sistema de secuenciación en línea Macrogen (http://dna.macrogen.com/kor/).

Transfección de ADN, purificación y caracterización de proteínas.

La línea celular de mamíferos Expi293.^TM se obtiene de Thermofisher Scientific. La transfección de ADN se realizó utilizando ExpiFectamine siguiendo el protocolo del fabricante (Thermofisher, A14635). Brevemente, el Expi293^TM las células se cultivaron a 37 ° C, 8% de CO₂y velocidad de agitación de 125 rpm de la incubadora (eppendorf, S41I230011) hasta tres o más pases antes de la transfección. El día de la transfección (día 1), 3 × 10⁶ Expi293^TM Se sembraron células/ml y se transfectaron con plásmidos pSectag2B purificados que contenían el FlaB gene. El día 2, se agregaron el potenciador I y el potenciador II y se cultivaron hasta el día 4. El día 4, transferimos el medio de cultivo a botellas de recolección y lo centrifugamos a 35,000 × g a 4ºC durante 20 min. El sobrenadante se recogió y se mezcló con tampón de lisis 10x (NaH 500 mM).₂PO₄, NaCl 1.5 M e imidazol 100 mM, pH = 8) en una proporción de 9:1. La mezcla se añadió a la columna Niken equilibrada que contenía 3 ml de perlas de agarosa Ni-NTA (Qiagen, 30230), para 30 ml de la mezcla de proteínas, a 4 °C. Para eliminar las proteínas no específicas, la columna se lavó con tampón de lavado I (NaH 50 mM).₂PO₄, NaCl 300 mM e imidazol 10 mM, pH = 8) y tampón de lavado II (NaH 50 mM₂PO₄, NaCl 300 mM e imidazol 20 mM, pH = 8). La proteína se eluyó con tampón de elución (NaH 50 mM).₂PO₄, NaCl 300 mM e imidazol 250 mM, pH = 8) a temperatura ambiente durante 15 min. El tampón se cambió a solución salina tamponada con fosfato (PBS) utilizando tubos de filtro centrífugos (Merck, UFC801024). La pureza de la proteína eFlaB recombinante se confirmó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y posterior análisis de transferencia Western utilizando anticuerpo anti-FlaB generado en ratones utilizando adyuvante completo de Freund (Sigma, CAS9007-81-2) y conjugado con HRP. anticuerpo secundario policlonal anti-ratón (Dako, P0260).

Ensayo informador de NF-κB dependiente de TLR5

Para medir la actividad estimulante de NF-κB de eFlaB con un amplio rango de concentraciones de proteínas (Figs. 1c y 2c), utilizamos HEK-Blue^TM Células hTLR5 (InvivoGen, hκb-htlr-5) con HEK-Blue^TM sistemas de ensayo de detección (InvivoGen, hb-det2) siguiendo el protocolo del fabricante. Calculamos la CE₅₀ utilizando valores de OD620 nm por triplicado para cada concentración de proteína. Para determinar la actividad biológica de las variantes de eFlaB desglicosiladas (Fig. 3b), realizamos un ensayo indicador de luciferasa NF-κB in vitro utilizando células HEK293T. Las células HEK293T se mantuvieron en medio DMEM (Gibco^TM, 11995-065) que comprende 10 % de FBS, 100 unidades/ml de antibióticos (Gibco^TM, 15140122) a 37 °C y 5% de CO₂. Se utilizaron al menos 3 pases de células para el ensayo indicador de NF-κB. Las células se sembraron a 2 × 10⁵/pocillo en placas de 24 pocillos (SPL Life Sciences, Corea, 30024) durante 24 h y transfectadas con el plásmido informador pNFκB-Luc (100 ng/pocillo), p3x Flag-hTLR5 (100 ng/pocillo) y 50 ng/pocillo. pocillo de pCMV-β-Gal usando 5 µl/pocillo de Effectene (Qiagen, Alemania, 301427) durante la noche. Las células transfectadas se trataron con pFlaB, eFlaB o eFlaB mutado a una concentración estequiométrica y se incubaron durante 24 h. Los medios se retiraron de los cultivos y se trataron las células con tampón de lisis celular (Promega, Madison, WI EE. UU., E153A). A partir de lisados ​​celulares, se midieron las actividades de luciferasa mediante un luminómetro (Berthold, Lumat-Plus LB96V).

Desglicosilación de eFlaB mediante tratamiento enzimático.

Los eFlaB se desglicosilaron mediante la enzima péptido N-glicosidasa F (PNGase F) (Promega, Madison, WI EE. UU., V483A) utilizando una forma no desnaturalizante siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, se añadió PNGasa F (10 U/μl) a eFlaB (15 μg) y se incubó a 37 °C durante 2 h.

Predicción del sitio de N-glicosilación

Predijimos los sitios de N-glicosilación de FlaB usando NetNGlyc-1.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0), una herramienta bioinformática que determina la secuencia consenso de N-glicosilación Asn-Xaa-Ser/Thr.

Mutagénesis dirigida al sitio

Mutagénesis dirigida al sitio de eflaB se realizó siguiendo el protocolo del fabricante (Enzynomics, Inc., Daejeon, República de Corea, EZ004M). Brevemente, el plásmido pSectag2B que contiene eflaB El gen se utilizó como plantilla para la reacción de PCR con cebadores específicos (Tabla complementaria 2) diseñado para mutar de “AAC” o “AAT” (Asparagina, N) a “GCC” o “GCT” (Alanina, A). el mutado eflaB Las secuencias fueron confirmadas por el sistema de secuenciación en línea Macrogen (http://dna.macrogen.com/kor/).

Co-inmunoprecipitación (Co-IP)

Brevemente, transfectamos las células HEK293T con el plásmido p3XFlag-hTLR5 durante 24 h. Las células se lisaron utilizando tampón RIPA que contenía inhibidores de proteasa, luego se sonicaron y luego se centrifugaron para recolectar el sobrenadante. Las proteínas, pFlaB, eFlaB, eFlaB^N83/101/139Ay eFlaB^{N83/101/139/273/330A}, se mezclaron con el sobrenadante, rotando a 4 °C durante la noche (complejo I). Al mismo tiempo, mezclamos la proteína A/G plus-agarosa (Santa Cruz Biotechnology, sc-2003) con un anticuerpo anti-etiqueta Flag (Abcam, ab1162; dilución 1:40) y lo rotamos a 4 °C durante la noche ( complejo II). Luego, lavamos el complejo II con tampón IP (TritonX-1 al 100%, Tris 25 mM pH 7.5, glicerol al 10%, NaCl 150 mM, DTT 1 mM, EDTA 1 mM e inhibidor de proteasa) 5 veces. A continuación, mezclamos el complejo I con II y rotamos a 4 °C durante 6 h. Finalmente, lavamos el complejo con tampón IP cinco veces para eliminar las proteínas de unión no específicas. Después del lavado, agregamos 50 μl de tampón de carga 1x SDS y lo hervimos durante 10 minutos. Se analizaron SDS-PAGE y otras transferencias Western. Hemos utilizado dos anticuerpos diferentes, anti-FlaB de ratón (dilución 1:2,000) y anti-Myc-HRP (Novex®, 46-0709; dilución 1:2,000), para el ensayo de transferencia Western para detectar variantes de pFlaB y eFlaB, respectivamente. , porque las proteínas eFlaB anti-FlaB detectaron bajas debido a la glicosilación en eFlaB, ya que las variantes de eFlaB se expresaron junto con Myc-tag, que fue bien detectada por anti-Myc (Fig. 2d).

Concanavalina Una columna para el análisis de proteínas N-glicosiladas

Verificamos si solo los eFlaB glicosilados se unen a la concanavalina A (ConA) utilizando el kit de aislamiento de glicoproteína ConA (Thermo Scientific, EE. UU., 89804) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, pipeteamos la suspensión de resina de lectina ConA en la columna de centrifugación y centrifugamos durante 1 min a 1,000 × g Enjuagar la resina tres veces con tampón de unión/lavado. Las proteínas se diluyeron en 200 μg de tampón de unión/lavado en 500 μl, se mezclaron con resina en la columna y se rotaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego la columna se centrifugó durante 1 min a 1000 × g para eliminar la proteína no unida. La resina de la columna se lavó varias veces con tampón de unión/lavado y se añadieron 100 µl de tampón de elución y luego se hizo girar la columna durante 5 minutos a temperatura ambiente. La columna se centrifugó nuevamente durante 1 min a 1000 × g para recolectar proteínas eluidas. Las proteínas no unidas y eluidas (unidas a ConA) se analizaron mediante SDS-PAGE.

Inmunización intranasal

Se adaptaron al huésped ratones BALB/c hembra de siete semanas de edad (ORIENT, Seongnam-si, Gyeonggi-do, Corea) en nuestras instalaciones durante una semana antes de continuar con los experimentos. A los ratones se les administró por vía subcutánea una mezcla de Zoletil® 50 (corporación Virbac, Carros, Francia) y Rompun.^TM (Elanco Animal Health Corea Co., Ltd.). Después de anestesiar a los ratones, les administramos por vía intranasal PBS, dividimos el antígeno H1N1 únicamente (sH1N1) (Green Cross, Hwasun, Corea), sH1N1+pFlaB, sH1N1+eFlaB, sH1N1+eFlaB.^N83A, sH1N1+eFlaB^N83/101A, sH1N1+eFlaB^N83/101/139A, sH1N1+eFlaB^{N83/101/139/273A}y sH1N1+eFlaB^{N83/101/139/273/330A}. Los antígenos de la vacuna se diluyeron en PBS hasta el volumen final de 20 µl/ratón, correspondiente a la dosis de sH1N1 0.2 µg/ratón y pFlaB o eFlaB 4 µg/ratón. Los ratones se inmunizaron tres veces a intervalos de 2 semanas, después de 2 semanas de la inmunización final se tomaron los sueros para el ensayo.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

Las respuestas de anticuerpos específicos de sH1N1, pFlaB y eFlaB se midieron mediante ELISA utilizando suero de ratón recolectado dos semanas después de la inmunización final mediante sangrado retroorbitario. Se recubrieron placas ELISA (Corning Laboratories, 3690) con sH1N1 (4 μg/ml), pFlaB o eFlaB (1 μg/ml) en PBS a 4 °C durante la noche y se bloquearon con tampón [1 mM de EDTA (JUNSEI, 17385S0401) y 0.5% de BSA (Sigma, A2153-50G) en PBS-T] durante una hora a temperatura ambiente (RT). El suero se diluyó en serie en tampón de bloqueo y se añadió 40 µl/pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 2 h. Las placas se lavaron 5 veces y se añadió anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con HRP (Southern Biotech, 1036-05; dilución 1:2,000) a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar 5 veces, la señal se desarrolló añadiendo sustrato de 3,3'5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (BD OptEIA, 555214) y se detuvo la reacción añadiendo 1 NH₂SO₄. La absorbancia se midió a 450 nm con un lector de microplacas (Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA). El título de anticuerpos se calculó como el valor Log2 recíproco de la dilución de suero que produjo valores de absorbancia 2 veces mayores que el pocillo en blanco.

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41541-023-00738-3