Preparación del cultivo de neuronas primarias.

Los protocolos experimentales relacionados con la recolección de tejido animal fueron aprobados por la oficina veterinaria del cantón de Basilea-Ciudad de acuerdo con las leyes federales suizas sobre bienestar animal y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices aprobadas. Se esterilizaron chips HD-MEA o cubreobjetos de vidrio en etanol al 70% durante 60 minutos y se lavaron con agua desionizada estéril bajo flujo de aire laminar. Luego se trataron la matriz de electrodos o los cubreobjetos con 10 µl de poli(etilenimina) al 0.05% (v/v) (Sigma-Aldrich) en tampón borato (Thermo Fisher Scientific) durante 40 minutos a temperatura ambiente y se lavaron con agua desionizada, seguido por incubación con 8 µl de 0.02 mg ml^-1 laminina (Sigma-Aldrich) en medio neurobasal (NB) (Gibco) durante 30 min a 37 °C. Se diseccionaron embriones de rata Wistar E-18 en HBSS helado (Gibco) para recolectar sus cortezas, que luego se disociaron en tripsina-EDTA al 0.25% (Gibco). Las células corticales disociadas se trituraron suavemente y se filtraron a través de un tamiz de 0.45 µm para obtener células individuales. Se estimó la densidad celular y se tomaron 10 µl de 3,000 células µl.^-1 La solución se sembró sobre la matriz de electrodos. Se permitió que las células se unieran a las matrices incubando los chips a 37 °C durante 40 minutos antes de agregar 2 ml de medio de recubrimiento NB. El medio de cultivo NB se preparó añadiendo 50 ml de suero de caballo (HyClone), 1.25 ml de glutamax (Invitrogen) y 10 ml de B-27 (Invitrogen) a 450 ml de Neurobasal (Gibco). Los chips HD-MEA se mantuvieron dentro de una incubadora de cultivo celular a 37 °C y 5% de CO.₂. Después de 3 días, las células se cultivaron en medio de cultivo NB sin suero hasta DIV 20 intercambiando el 50% del medio de cultivo con medio de cultivo NB nuevo una vez cada 3 días. Todos los experimentos, excepto los datos que se muestran en la Fig. 1i, se realizaron entre DIV 14 y 16 porque las células mostraron diferentes propiedades mecánicas durante el crecimiento¹¹. Los experimentos para los datos mostrados en la Fig. 1i se recolectaron entre DIV 22 y 24, cuando las redes neuronales mostraron actividad de explosión sincrónica.

Preparación de rodajas de cerebelo

Se decapitaron ratones de tipo salvaje (día posnatal 14 C57BL/6Rj, Janvier Labs) bajo anestesia con isoflurano; sus cerebros fueron extraídos y sumergidos en burbujas de carbono heladas (95% O₂ + 5% CO₂) solución de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF). Cortes cerebelosos sagitales de ~Se obtuvieron 350 µm utilizando un vibratomo (VT1200S, Leica). Todas las rodajas se mantuvieron a temperatura ambiente en LCR hasta su uso. El LCRa estaba compuesto por NaCl 125 mM, KCl 2.5 mM, CaCl 2 mM.₂, 1 mM MgCl₂, glucosa 25 mM, NaH 1.25 mM₂PO₄ y NaHCO 25 mM₃. Luego se trató la matriz de electrodos de los chips HD-MEA con 10 µl de poli(etilenimina) al 0.05 % (v/v) (Sigma-Aldrich) en tampón borato (Thermo Fisher Scientific) durante 40 minutos a temperatura ambiente y se lavó con solución desionizada. agua, seguido de una incubación con 8 µl de 0.02 mg ml^-1 laminina (Sigma-Aldrich) en medio Neurobasal (Gibco) durante 30 min a 37 °C. Se pipeteó el exceso de laminina después de la incubación y se dejó secar la matriz. Luego, la rebanada de cerebelo se colocó suavemente sobre la matriz de electrodos usando una punta de pipeta cortada para evitar daños causados ​​por las fuerzas de corte durante el pipeteo (Figura complementaria. 13). Se colocó un arpa hecha a medida de 2 mm sobre el corte de tejido para inmovilizar el corte de tejido. Luego se sumergieron rodajas de tejido en aCSF añadiendo suavemente gota a gota. Luego se permitió que el corte de tejido inmovilizado sumergido en aCSF se adhiriera a la matriz de electrodos durante 30 minutos. Justo antes de la grabación, se quitó el arpa y se montó el cabezal AFM en el chip HD-MEA. El tejido se perfundió continuamente con aCSF burbujeado con carbono para mantener la viabilidad y actividad celular.

Configuración HD-MEA

Chips HD-MEA basados ​​en semiconductores de óxido de metal complementario (CMOS) con 26,400 electrodos (paso de 17.5 µm) dentro de un área de detección total de 3.85 × 2.10 mm² fueron usados²⁵. Los chips se fabricaron en una fundición comercial y se postprocesaron y empaquetaron internamente (Fig. 1b). Se pegaron anillos de policarbonato transparente (GB Plex) de 4 cm de diámetro sobre los chips y las uniones de cables se encapsularon con epoxi oscuro biocompatible (EPO-TEK 353 ND). El recubrimiento negro platino de los electrodos se electrodepositó para disminuir la impedancia del electrodo y mejorar las características de señal a ruido (Figura complementaria). 1c). Se pueden adquirir versiones comerciales de nuestro sistema HD-MEA desarrollado a medida (modelo MaxOne) en MaxWell Biosystems.

Portamuestras y calentador de platina

Un calentador de muestra termoeléctrico basado en Peltier, con una sonda de temperatura para retroalimentación de circuito cerrado, fue controlado por un controlador de temperatura casero para mantener la muestra a 37 °C. El calentador de muestra se alineó con la almohadilla de conducción térmica del chip HD-MEA. Luego, los chips se montaron en un soporte de muestra y se fijaron en su posición con el pasador accionado por resorte del soporte. Se utilizó Prusa I3 MK3S+ para imprimir en 3D los frugales soportes de jeringas para la configuración de perfusión que se adjuntaron al soporte de muestra. Toda la configuración se montó en un soporte hecho a medida. x,y etapa piezoeléctrica a través de una placa base.

x,y etapa piezoeléctrica

Se conectaron entre sí perpendicularmente dos etapas piezoeléctricas lineales (serie Xeryon XLS-1) con una resolución de codificador de 5 nm (Fig. 1a). Las etapas lineales fueron controladas por un controlador multieje Xeryon XD-M conectado a una interfaz de usuario basada en LabVIEW. El electrodo superior izquierdo del chip HD-MEA se registró como el origen del sistema de coordenadas y las coordenadas del electrodo con las neuronas de interés se extrajeron de la interfaz de usuario de MaxWell Biosystems. Luego, estas coordenadas se enviaron al controlador XD-M mediante scripts personalizados para facilitar el posicionamiento de las neuronas debajo del voladizo del AFM.

Microscopía de fluorescencia de larga distancia de trabajo.

Se alineó un microscopio óptico (Nikon SMZ 25) con lentes de zoom ajustables de 15.75 × y objetivo de 1 × (Nikon, MNH55100 P2-SHR PlanApo 1X; apertura numérica, 0.156) con la configuración como se menciona en el texto principal. Un iluminador de diodo emisor de luz (LED) controlable por TTL (CoolLED PE 300^Ultra) se utilizó como fuente de luz para obtener imágenes sin filtros de excitación/emisión. Se utilizó un divisor de haz de paso de banda triple (F66-412, AHF Analysentechnik) para filtrar la luz de excitación reflejada del chip HD-MEA. Una gran cámara CMOS (Nikon DS-QI2) con 4,908 × 3,264 píxeles (tamaño de píxel, 7.3 × 7.3 µm²) se montó en el microscopio utilizando una lente de proyector montada en f de 2.5 × que permite un muestreo de hasta 45 fps con un aumento final de ~40× y una resolución de 0.46 µm por píxel.

AFM

Se montó un cabezal AFM (Catalyst, Bruker) y se alineó con la configuración como se menciona en el texto principal. Se utilizó un escáner piezoeléctrico de 15 µm en la cabeza para recopilar todas las curvas de fuerza-desplazamiento y fuerza-tiempo, mientras que se usó un piezoeléctrico de 150 µm para colocar el voladizo en la neurona. Los datos se recopilaron y exportaron a archivos .txt utilizando el software AFM (Nanoscope v.9.2, Bruker). Los datos fueron analizados y trazados con scripts de Python. Se pegaron perlas de sílice con un diámetro de 5 μm (Kisker Biotech) al extremo libre de micro voladizos sin punta (CSC-37 o 38, Micromash HQ) usando pegamento ultravioleta (Dymax) y se curaron con luz ultravioleta durante 20 minutos. Los voladizos con cuentas se limpiaron durante 5 minutos usando un limpiador de plasma (Harrick Plasma), luego se montaron en el soporte de la sonda de fluido con una ventana de zafiro de 2 mm y se calibraron usando el método de ruido térmico.⁴⁸.

AFM correlativo, HD-MEA y microscopía óptica.

El AFM, el HD-MEA y el microscopio óptico se alinearon como se muestra (Fig. 1a). La luz fluorescente de las neuronas en los chips HD-MEA se recogió a través de una ventana de zafiro en el soporte voladizo del AFM y se pasó al microscopio óptico. La imagen de fluorescencia de las neuronas en el chip HD-MEA se recopiló secuencialmente en regiones de interés, se cosieron y registraron en la interfaz de usuario de Maxwell MEA para localizar las neuronas en el chip HD-MEA (Figura complementaria. 2a–d). La x,y Luego se enviaron las coordenadas de las neuronas de interés al x,y escenario a través de scripts de LabVIEW, colocando así el voladizo AFM en las posiciones deseadas con ~Precisión de 5 nm. Todo el conjunto se instaló sobre una mesa aislada con amortiguación y se colocó en una cámara protegida contra el ruido y con temperatura controlada para reducir el ruido mecánico y la deriva térmica.

Sincronización TTL

Los pulsos TTL de DS-Qi2 se extrajeron utilizando un conector casero con una clavija de cuatro polos de 3.5 pulgadas, un mini enchufe en un lado y un puente hembra de 24 AWG (RND 255-00015, Distrelec) en el otro lado. El pin 1 era tierra y el pin 4 (EXP_TMG) recibía 2.4 V en nivel HI (alto) en funcionamiento en vivo de acuerdo con el tiempo de exposición establecido. Se extrajo un pulso negativo de 0 a 5 V del canal de salida 1 del panel frontal del controlador AFM (Bruker Nanoscope V) a través de un conector casero con un pin macho BNC estándar en un lado y un puente hembra de 24 AWG (RND 255). -00015, Distrelec) del otro lado. Las señales, extraídas tanto de la cámara como del AFM, se enrutaron luego a los pines 2 y 8 de un único optoacoplador de alta velocidad. Luego, las señales se enviaron al sistema de adquisición de datos HD-MEA a través de una matriz de puertas programables en campo, proporcionando marcas de tiempo precisas de los eventos detectados por AFM y microscopía óptica en grabaciones de archivos sin procesar de datos HD-MEA recopilados a 20 kHz.

Protocolo de seguimiento y mediciones de rigidez.

El módulo de Young aparente se calculó a partir de un promedio de cinco curvas de fuerza-desplazamiento recogidas en el soma neuronal. Luego esperamos 30 s para asegurarnos de que no hubiera cambios mecánicos inducidos por la medición en las neuronas y recolectamos cinco curvas de fuerza-desplazamiento nuevamente (Fig. 2a), que denominamos como un ciclo de medición y que está representado por un punto (Fig. 2b). Repetimos este ciclo de medición hasta 5 minutos en una neurona y pasamos a la siguiente neurona de la red. Sesenta minutos después de la primera medición en la primera neurona, regresamos a la misma neurona y se repitió el ciclo de medición. Las mediciones comprendieron un ciclo de seguimiento a larga escala de tiempo. Este ciclo de seguimiento a larga escala se repitió tres veces (Fig. 2c). Para medir la rigidez de las neuritas, primero registramos la actividad electrofisiológica de las neuronas durante 5 minutos y luego identificamos dos neuritas bien aisladas por neurona y recopilamos curvas de fuerza-desplazamiento sobre ellas. Las curvas de fuerza-desplazamiento se recogieron utilizando micro voladizos CSC-38 (constante de resorte nominal, ~0.02 N·m^-1) con perlas de 5 μm de diámetro como se mencionó anteriormente. Se utilizó una fuerza máxima de 700 pN en somas y de 400 pN en neuritas para recolectar curvas de fuerza-distancia (Figura complementaria). 14a, b). Para todas las mediciones, la velocidad de la punta se mantuvo constante en 10 µm s.^-1. El punto de contacto se determinó a partir de la curva de fuerza-desplazamiento de aproximación como x interceptar a un valor de fuerza, que era cinco veces mayor que la desviación estándar del ruido de referencia, seguido de una curación manual. La profundidad de indentación se calculó como el valor de desplazamiento en el punto de contacto después de restar la deflexión del voladizo y establecer el valor de desplazamiento en la fuerza máxima a cero en la curva fuerza-desplazamiento (Figura complementaria. 14c). La profundidad de la sangría para la misma fuerza máxima dada variaría de un soma a otro dependiendo de su rigidez. Por lo tanto, hemos establecido un límite de profundidad de indentación de 750 nm. En las curvas de fuerza-desplazamiento, se descartaron todos los valores de fuerza para los cuales el valor de desplazamiento correspondiente excedió el límite de profundidad de indentación. El módulo de Young aparente se calculó a partir de curvas a las que se aplica el modelo de Hertz para un penetrador esférico con un semiespacio elástico.⁴⁹ Se instaló utilizando códigos personalizados en Python.

Los valores del módulo de Young medidos en nuestro estudio para el soma de las neuronas se encuentran en un rango comparable con informes anteriores.^10,11. Sin embargo, el módulo de Young de las neuritas es inferior a los valores informados, aunque todavía se encuentran en un orden de magnitud comparable. Este sesgo podría deberse a nuestra elección de medir las dos neuritas basales más gruesas de la neurona, que suelen ser más blandas. Para medir la rigidez de los somas neuronales durante la explosión y los IBI, hemos recopilado curvas de fuerza-desplazamiento a una frecuencia de 5 Hz. Este proceso se repitió varias veces para cada soma y se calculó la rigidez promedio del soma durante los períodos de explosión y durante los IBI. Si bien los estallidos suelen aparecer en un patrón rítmico (Fig. 2h), es difícil predecir para las neuronas cultivadas cuándo una sola neurona sufre estallido. Para recopilar al menos dos curvas de fuerza-desplazamiento durante los períodos de explosión o IBI, minimizando al mismo tiempo el número de veces que la sonda entra en contacto con la neurona, sangramos la neurona 5 veces s^-1.

Protocolo de compresión estática

Una perla de 5 µm de diámetro, pegada a un micro voladizo AFM sin punta (CSC-37; constante de resorte nominal, ~0.8 N·m^-1), se colocó encima del soma. La perla se bajó sobre el soma hasta que se alcanzó una fuerza de punto de ajuste requerida para aplicar 0.1 kPa o 5 kPa y se mantuvo en contacto durante 60 s usando retroalimentación de altura constante antes de retraer la perla (Fig. 5b). La curva fuerza-tiempo registrada a una frecuencia de muestreo de 500 kHz muestra tanto el desplazamiento vertical de la cabeza del AFM como la respuesta de fuerza del soma. La altura promedio del soma de las neuronas corticales de rata fue ~8 µm (Fig. 11a).

Imágenes de calcio funcional

Se expresaron sensores de calcio codificados genéticamente en neuronas utilizando virus adenoasociados (AAV). AAV1-EF1a-GCaMP6s (1.8 × 10¹³ genomas virales ml^-1) se utilizaron en una multiplicidad de infecciones de 5.0 × 10⁴ para expresar GCaMP6s. Las neuronas fueron infectadas en DIV 3; La expresión generalmente se observaba en DIV 5-9.

Análisis de imágenes de calcio funcional de neuronas estimuladas mecánicamente.

Una curva de intensidad de fluorescencia promedio ΔI/I de la curva GCaMP6s se calculó como la señal media en toda la imagen en relación con la línea de base de la imagen. La detección de picos en la señal se realizó encontrando máximos locales dentro de una ventana de 3 s. Se marcó un evento como el inicio de una respuesta neuronal cuando la amplitud de la señal de calcio alcanzó el 10% del valor máximo. Datos de 2.5 s antes y 10 s después del inicio del pico de respuesta (t = 0) fue trazado.

Grabaciones HD-MEA

Se utilizó la interfaz de usuario de MaxWell Biosystem (MaxLab Live v.22.13) para registrar los datos. La imagen de fluorescencia del chip completo se registró en la interfaz de usuario (Fig. 2c). Se identificaron neuronas de interés a partir de picos de calcio y la actividad de picos (potenciales de acción) se obtuvo de los gráficos ráster en vivo en la interfaz de usuario. Una vez que se identificó una neurona de interés, se dirigieron a la lectura 512 electrodos alrededor de esta neurona en una configuración rectangular. Después de colocar el voladizo del AFM en la neurona, los canales se desplazaron cinco veces para compensar el ruido del láser infrarrojo utilizado por el AFM para detectar la desviación del voladizo antes de comenzar la grabación. Para todas las grabaciones se utilizó una ganancia de 512 y un filtro de paso alto con un corte de 300 Hz. Para mejorar el rendimiento de los algoritmos de clasificación de picos en la Fig. 5, los potenciales de acción neuronales se registraron 2.5 minutos antes y después de la estimulación mecánica.

Análisis de datos HD-MEA

Todos los datos HD-MEA recopilados se procesaron mediante scripts personalizados basados ​​en la interfaz Spike.⁵⁰. Brevemente, las grabaciones extracelulares se filtraron y clasificaron mediante picos utilizando Kilosort2, seguido de la curación manual de todas las grabaciones. Para la curación se utilizó un umbral conservador de violación del intervalo entre picos de 0.5 y un umbral de relación señal-ruido de 5.0. Se utilizaron similitudes de plantilla, autocorrelogramas y correlogramas cruzados para la evaluación de la calidad de la unidad. Las características de la forma de onda, como el ancho medio y la pendiente de repolarización, se extrajeron para unidades ordenadas por picos para las épocas respectivas con scripts de Python utilizando funciones de Spikeinterface (Figura complementaria). 12a-yo). Los cambios relativos en las características de la forma de onda en todos los electrodos dentro de la huella extracelular de una neurona se obtuvieron dividiendo el valor de la característica de la forma de onda media de todos los picos durante la compresión mecánica por la característica de la forma de onda media de todos los picos antes de la compresión. La velocidad media de disparo y el intervalo entre picos se calcularon a partir de los trenes de picos extraídos utilizando el kit de herramientas de análisis de electrofisiología Elephant 0.11.2.⁵¹. Las tasas medias de disparo para los datos de correlación de rigidez se calcularon colocando los picos en intervalos de 30 s para que coincidan con los puntos temporales de los valores de rigidez. Las tasas medias de disparo para el protocolo de compresión se calcularon colocando púas en tres contenedores antes, durante y después de la compresión.

AFM combinado y microscopía confocal.

Las imágenes confocales de lapso de tiempo se realizaron en un microscopio confocal de barrido láser invertido (Observer Z1, LSM 700; Zeiss) equipado con un objetivo de inmersión en agua LCI PlanApo de 25 × / 0.8 (Zeiss). Se montó un AFM (CellHesion 200; JPK Instruments) en el microscopio confocal. Los protocolos de compresión mecánica se ejecutaron utilizando el software JPK CellHesion. Para la estimulación mecánica, se utilizó AFM para acercar el voladizo con la perla a la celda a velocidades de 0.1, 1, 10 o 100 μm s.^-1 hasta alcanzar la fuerza de consigna y, posteriormente, retrocedió inmediatamente a la misma velocidad con la que se utilizó para la aproximación. Para los experimentos que determinan la fuerza umbral para estimular mecánicamente las neuronas, la fuerza de punto de ajuste aplicada se incrementó gradualmente de 50 a 400 nN en incrementos de 50 nN e intervalos de 20 s (Figura complementaria). 6). La fuerza de referencia de la cuenta que se acercaba se incrementó gradualmente hasta que se registró una respuesta neuronal. Después de una estimulación exitosa de la neurona, se retrajo el voladizo y se seleccionó una nueva neurona para la estimulación.

análisis estadístico

Todos los datos que muestran propiedades de forma de onda se probaron para determinar su normalidad con la prueba de Shapiro-Wilk y Q–Q parcelas. Todos los grupos de datos no estaban distribuidos normalmente y eran grupos de datos dependientes. Por lo tanto, utilizamos la prueba de rangos con signo de Wilcoxon. La hipótesis nula fue que no hay diferencia en las medianas entre las distribuciones comparadas por pares. P valores >0.05 se consideraron no significativos. Las características de la forma de onda se extrajeron de la forma de onda promediada de cada neurona obtenida de n > 5,000 picos. Todos los datos que muestran tasas medias de despido se compararon con la prueba de rangos con signo de Wilcoxon de n > 10,000 picos. Los grupos de datos de AFM se compararon utilizando el método Mann-Whitney de dos colas. U-Test. P Los valores para cada comparación se mencionan en las leyendas de las figuras. Se utilizó la correlación de Pearson para determinar las correlaciones lineales en la rigidez y los valores medios de velocidad de disparo. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar los tamaños de muestra. La recopilación y el análisis de datos no se realizaron a ciegas con respecto a las condiciones de los experimentos.

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de la cartera de naturaleza vinculado a este artículo.

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41565-024-01609-1